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shRNA表达克隆

基于小RNA技术的基因治疗研究的黄金时期

May 06, 2008 No Comments

I 基于小RNA技术的基因治疗研究的黄金时期

   

        所谓基因疗法,即是通过基因水平的改变来治疗疾病的方法。目前的基因疗法是先从患者身上取出一些细胞(如造血干细胞、纤维干细胞、肝细胞、癌细胞等),然后利用对人体无害的逆转录病毒为载体,把正常的基因装载进病毒,再用这些病毒去侵染取出的人体细胞,让它们把正常基因插进细胞的染色体中,于是人体细胞就可以“获得”正常的基因,以取代原有的异常基因;接着把这些修复好的细胞培养、繁殖到一定的数量后,送回患者体内,这些细胞就会发挥“医生”的功能,治疗疾病[1]。虽然一定情况下,补充某种过量的蛋白质也可以改善病情,但无法达到基因疗法能彻底治疗疾病的同等效果。在应用基因疗法治疗疾病时,适当关闭或下调某个基因的表达十分重要。癌症就是个典型的例子,体内正常基因的不正确表达或是发生功能获得性突变(gain-of-function mutation)都有可能改变细胞周期、加剧细胞增殖失控,从而引发癌变。

       在接下来的文章中,我们将对小RNA在基因治疗中的应用作一个比较系统的系列综述。该系列综述的重点将会放在RNA干扰(RNAi)和microRNA(miRNA)上面,同时也会介绍其它一些基于RNA的基因疗法。我们将会着重讨论小RNA在医疗中潜在的应用价值以及相应的弊端。

       将miRNA或RNAi用于基因治疗的想法最初源于一些从事基因治疗行业的科研人员在实际工作中遇到的问题,如“RNAi和miRNA介导的基因敲除之间有何区别”以及“在以前基因敲除技术并不成熟的时候,RNAi是否真的能发挥效用”。显然,诸如此类的问题并没有简单或是明确的答案。或要想解决这些问题,我们首先要给出一个明确的定义,即RNAi和miRNA分子都是短小的、双链RNA分子(大约21碱基对的长度),这些RNA分子可以在转录后水平上部分或完全沉默某一特定基因的表达。而该过程仅在mRNA含有小RNA同源靶序列时才会发生。

       RNAi比以前各种基于基因敲除的基因治疗法都要成功的主要原因是一切哺乳动物细胞中都存在内源性RNAi或miRNA。RNAi和miRNA通路之间存在很多显著的异同之处,一般来说,RNAi会造成基因位点特异性的断裂,而miRNA的敲除功能则源于mRNA的翻译阻遏和/或mRNA更新率的提高。小RNA和它的mRNA的靶位点完全互补匹配时会活化由RNAi引起的断裂途径,而miRNA介导的抑制过程只需二者间有部分序列匹配即可。一般越低等的生物,它们的RNA越有可能通过介导相应基因染色质或DNA的修饰来触发转录后的抑制过程,而在哺乳动物中是否存在这一过程尚存有争议。

       人们通过对哺乳动物基因组内源miRNA基因序列进行相关研究,发现至少存在500个或更多不同类型的RNA调控着我们机体内大约1/3的基因。这一调控过程进一步加强了生物体在发育过程、细胞周期以及免疫和代谢途径中对基因复杂的调控网络的控制。当然,这些miRNA是如何被控制的还有待进一步探索,但现在已有很多科研人员尝试研究这些生理过程的异常调节对诸如神经功能缺损、癌症、免疫失调以及感染的发病意义。

       当RNAi在一次不经意的植物转基因研究过程中首次作为一个概念被提出后,其作用机理最早由Fire、Mello等人于九十年代末在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中阐明[2],这一发现获得了2006年的诺贝尔医学和生理学奖。起初,这项发现曾引起人们对于哺乳动物是否存在RNAi现象这一问题产生了极大的争论。随后Tuschl等人证明了哺乳动物细胞中存在RNAi现象,从而掀开了人类疾病疗法的新篇章[3]。

       基于RNAi技术的疗法可以被分为两大类,第一类是成熟的siRNA分子以双链裸露的RNA形式或RNA与载体结合的方式被传递。RNA的核苷酸可以被修饰,以降低其毒性并/或当运输至含有核酸酶的体液时延长其活性。由于siRNA在细胞内的半衰期有限,因此它们的活性在细胞内会受到限制。第二类是用DNA作为转录模板以使短的含发夹结构的RNA(shRNA)形成成熟的siRNA。尽管这些疗法都受到载体的限制,但一般都会产生强烈且持久的RNAi活性。

       过去几年,不断有人尝试在临床前期的疾病模型中应用小RNA。在这些尝试中至少有6个临床实验获得了成功,其中包括了用载体表达的shRNA和基于siRNA技术的基因疗法,这些疗法都很有希望应用于临床药物的开发。在前人的这些临床实验的启示下,下一步关键问题是明确影响小RNA基因疗法效率的关键因素究竟是因为基因敲除的特异性,还是因为存在多种非特异性应答形式。

       在过去的十年里,小RNA在生物动态平衡中所扮演的角色越来越为人们所了解。但是,即使有新型技术(尤其是大规模测序平台)的支持,我们对于小RNA具体功能的认识还只处于表面阶段。对内源RNAi/miRNA途径的阐明不但使人们对基因的调控和功能有了更清晰的了解,而且也帮助我们在细胞中发现更多其它类型的小RNA,不过这些小RNA产生的机制以及它们在基因调控过程所起的作用还不甚明确,但对于研究RNA的生物学家及探索疾病治疗新技术的医学工作者而言,这些发现十分振奋人心。毫无疑问,小RNA技术已经成为一个新的疾病治疗研究平台。

原文检索:HUMAN GENE THERAPY 19:15–16 (January 2008). Mary Ann Liebert, Inc. DOI: 10.1089/hum.2007.1220

参考文献:

1  基因疗法http://baike.baidu.com/view/37653.htm

2  FIRE, A., XU, S., MONTGOMERY, M.K., KOSTAS, S.A., DRIVER, S.E., and MELLO, C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806–811.

3  ELBASHIR,S.M., HARBORTH, J., LENDECKEL, W., YALCIN, A.,WEBER, K., and TUSCHL, T. (2001). Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494–498.

(生命奥秘:葛晶/编译)

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