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shRNA表达克隆

基于miRNA的RNAi基因治疗方法

May 06, 2008 No Comments

(II)基于miRNA的RNAi基因治疗方法

(i) RNAi trigger:基因治疗的新工具

       自从RNAi现象被发现以来,研究者们一直致力于增强基因沉默方法的效力。其中一种方法是将RNAi trigger导入天然存在的miRNA中,从而提高沉默效率。在该方法中,需要将内源pre-miRNA中的中心序列,如miR-26a[77]和miR-30[78,79]置换成可以和目的片段特异性结合的RNAi trigger,从而提高RNAi的沉默效率。其前提是,所置换的这段序列必须被RNAi机制所识别。

       在设计RNAi trigger时,需要注意保留原序列中位于Drosha酶切位点周围的片断,该片断在很大程度上决定了RNAi的沉默效率[88]。在对天然miRNA沉默的机制更深入了解的基础上,我们将有望设计出功能更为强大的基因沉默工具。Boden及其同事发表文章,指出pri-miRNA与shRNA相比,能够更为有效地被RNA干扰,因此,沉默效率可提高80%[79]。与包含人工环状序列的发夹结构相比,包含来源于pri-miRNA的环状序列的发夹结构能够更为有效地被转运至细胞质[89]。目前,许多科研机构都采用这一方法开展基因沉默研究。采用基于miRNA的RNAi trigger技术进行基因沉默,其沉默效率可达到95%以上(A. McCaffrey, 未发表)。重要的是,pri-miRNA可以在Pol II启动子的作用下表达[79],这意味着除诱导表达外,还可采用组织特异性启动子进行表达。而基于miRNA的RNAi trigger可以在Pol III启动子的作用下高水平表达。因此,在内源miRNA环境下进行RNAi trigger的表达具有非常显著的优势。

(ii) 外源RNAi trigger与内源miRNA间的竞争

       所有药物都有相应的“治疗窗”(见文后小词典2):剂量不足,则不能达到疗效;超过规定剂量,又会引起毒性反应。Grimm及其同事曾在文中指出,当shRNA在小鼠体内严重过表达时,会引起小鼠的急性中毒反应[90]。Grimm等推测导致这一反应的原因,有可能是shRNA与miRNA核转运因子Exportin-5相结合,因此竞争性抑制了内源miRNA从核内向细胞质的转移。长时间表达上述shRNA会导致肝细胞内内源miRNA如miR-122的减少。需要注意的是,在此类研究中使用了大量的腺相关病毒(AVV)血清型8以确保将shRNA 100%地转导入肝细胞内。该研究结果表明,需要设计出效能尽可能强大的RNAi trigger,这样即使在亚饱和剂量下,仍然可以达到沉默基因的效果。另外,对trigger的表达调控以及组织特异性的调控同样十分重要。如有可能,在有关RNAi的前期临床试验及临床试验中,应对Exportin-5的饱和程度进行监测。

       如果Exportin-5是RNAi trigger与内源miRNA竞争的唯一靶标,那么,siRNA(不需要借助Exportin-5进行转运)是不会与内源miRNA形成竞争的。然而,Rossi小组发现,在培养细胞中,外源shRNA和siRNA都会和miR-21竞争,表明Exportin-5下游还有大量与外源shRNA和siRNA竞争的因子的存在[91]。有趣的是,具有相同guide strand的基于外源miRNA的RNAi trigger不会与miR-21发生竞争[91]。尽管这一证据表明,RNAi trigger在内源miRNA存在的情况下表达,相对于上文中竞争性结合的情况,安全性增加了,但是还需要更多的试验来进一步予以证实。John及其同事发现,用脂质体转运系统将大剂量的siRNA转入小鼠肝细胞,可以非常有效地但是暂时地沉默两个肝细胞基因的转录,并且不会干扰肝脏内三种miRNA的水平[92]。

       需要注意的是,在这一试验中,只需在两个时间点进行检测(第2天和第30天),基因沉默现象只能在第2天被观察到。相反,Grimm等人观察到,在第25天后,病毒载体表达了shRNA,这时便会出现毒性[90]。John等人采用脂质体系统将siRNA转入仓鼠体内,进一步对长时间基因沉默(21天)进行研究。研究人员观察到了对肝细胞表达甾体调节因子结合蛋白(SREBP)转录本的有效沉默,且未见miR-122表达量的下降。miR-122是目前所知的肝细胞内最丰富的miRNA。更长时间的转录本沉默(如25天)是否会影响miR-122的水平或肝细胞内其它miRNA的水平仍然是吸引研究人员目光的课题。至于siRNA和内源miRNA对于RNAi基因沉默效果是否会互相竞争及干扰,还需进一步的研究。对于每种外源RNAi trigger,在其沉默性能与毒性之间都需要找到最好的平衡点。

(iii) siRNA的Seed sequence是决定会否发生脱靶效应的关键片段

       最初将siRNA用作基因沉默手段时,人们普遍认为它的作用具有高度特异性。但是,越来越多的微阵列比较分析研究结果表明,有一些siRNA(据推测还包括一些shRNA)会发生脱靶降解mRNA的现象,这些mRNA往往含有与siRNA的靶标相近的序列[93,94]。最近有研究表明,siRNA与mRNA只要在3’ UTR有7个核苷酸配对,就可以导致mRNA的脱靶降解[95]。一项针对产生脱靶效应的12种不同的siRNA所做的生物信息学及微阵列分析表明,在脱靶沉默过程中,siRNA与miRNA行使功能的机制相同[96]。

       siRNA任何一条链上第2–7或2–8个核苷酸这段序列与mRNA的3’ UTR序列互补,且与脱靶沉默效应有关。该序列事实上与miRNA的seed sequence是等效的。如果3’ UTR与多个seed sequence配对,就更容易导致脱靶效应的发生。与5’ UTR或编码区同源的序列则不会导致脱靶效应。因此,在选择siRNA序列的时候,需要特别注意避免选择那些含有与mRNA的3’ UTR同源的seed sequence的guide strand或passenger strand。这种脱靶效应与siRNA所导致的基因沉默的机制是十分类似的。很明显,我们在选择治疗性siRNA或shRNA序列的时候,要注意脱靶效应的发生。Dharmacon/Thermo Fisher Scientific (Lafayette, CO)公司提供了一个数据库,可供查找siRNA序列中的seed sequence (见http://www.dharmacon.com/seedlocator/default.aspx)。这些研究结果也表明了在siRNA筛选时进行正确选择与控制的重要性。如果某种表型与某一敲除的mRNA相关,那么所有针对该mRNA的siRNA也应该产生相同的表型。更加精确的试验展示了一个突变基因对RNAi的免疫现象,该突变基因包含siRNA结合位点的沉默突变,因此可以阻止siRNA的沉默作用。最后,脱靶效应具有剂量依赖性[97],因此要获得足够的基因沉默需要给予一个最低剂量。

       综上,由于RNAi和miRNA在抑制mRNA转录方面有一部分机制是共同的,因此在设计RNAi trigger时需要格外谨慎。如果RNAi trigger能够达到最大效力,就可相应减少所需的剂量,同时也会减少与内源miRNA竞争的可能性。另外,由于RNAi trigger在行使功能时与miRNA相似,还需要谨防脱靶效应的产生。

(iv) 利用miRNA避免机体对病毒载体产生的免疫应答

       Naldini及其同事发表文章,记述了一种巧妙运用miRNA进行基因治疗的方法[98]。众所周知,阻碍基因替代疗法发展的一个重要因素,是由于转基因特异性免疫反应的存在[99]。例如,在一项对血友病进行的基因治疗试验中,机体对病毒载体和转入的目的基因产生了免疫应答从而导致实验受阻[100]。产生转基因特异性免疫应答的一个主要原因,是由于转入的目的片段会经由抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APCs)处理,然后呈递给机体免疫系统[101]。而组织特异性启动子由于特异性不高,因此不足以阻止上述发生在APCs内的表达。Brown及其同事于2006年发表了一篇思维缜密,言之有据的文章,深入阐明了一个事实:miR-142-3p在造血细胞内有丰富表达[102,103]。

       研究人员在慢病毒的3’ UTR构建了四个基因位点,它们能与机体内miR-142-3p完全互补。该慢病毒同时还携带编码绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的基因[104]。研究者将缺乏miR-142-3p位点的对照组慢病毒载体注射入小鼠体内,并于实验后第五天进行观察。他们发现GFP在肝细胞、内皮细胞、Kupffer细胞(即肝巨噬细胞)和脾细胞内都有所表达。但是,到注射后的第十四天,便几乎无法观察到GFP的表达了。据推测,可能这种慢病毒载体已被小鼠免疫系统所清除。然后,研究人员又给小鼠注入了同时含有GFP基因及在3’ UTR含有四个miR-142-3结合位点的慢病毒,结果发现在低于1%的脾细胞内可以见到GFP的表达,且只存在于边缘区(脾的边缘区是没有造血功能的)。

       研究人员发现,注入后一种慢病毒载体的小鼠体内,其GFP可以长时间在体内表达(120天),这大概是由于该类载体逃过了小鼠机体的免疫应答。结合上文有关miRNA的各项研究报告,Brown等推测,含有某种miRNA结合位点的转基因的高表达可能与内源miRNA靶标在与相应同源mRNA结合的过程中形成竞争。有趣的是,当研究人员用另一个含有miR-142-3p结合位点的报告基团进行转染时,并未见到GFP表达有所上升。这一结果表明,miR-142-3p并非只限定于这一个系统。尽管还没有实验证明,但研究者认为这很有可能是由于miRNA与靶标之间是完全互补的。因此,我们也可以预测,miRNA会降解相应靶标,周而复始,而不是仅仅与之相结合。Brown及其同事在另一项研究中,采用上述同样的方法,实现了人凝血因子IX在B型血友病小鼠体内的长期表达[105]。我们完全可以相信,该方法可以推而广之,用于其它转基因在体内的长期表达。

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