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shRNA表达克隆

miRNA生物合成

May 06, 2008 No Comments

       RNAi是一种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象。RNAi行使功能的机制与miRNA相同,都是一种在进化上十分保守的RNA-蛋白质机制。miRNA是由21至23个核苷酸组成的内源非编码RNA。随着RNA为基础的治疗方法学的不断发展与成熟,对于miRNA通路及转录后基因沉默机制的研究便显得尤为重要。已有研究发现,miRNA在人体发育和疾病发生过程中扮演着关键性的角色,并且基因表达调控的复杂程度超出人们预想。本综述将涉及miRNA成熟机制方面的进展,miRNA的作用方式及其在RNA为基础的治疗中的应用。       人们最初在植物和真菌中观察到RNAi现象——某一基因的复制性拷贝可以抑制其本身及其来源基因的表达[1,2]。Andrew Fire和Craig Mello在对线虫的研究中发现,RNAi现象是由双链RNA介导的,这一发现为两位科学家赢得了诺贝尔奖[3]。之后,David Baulcombe又证实了植物中的RNAi效应的介导者是一种由21至25个核苷酸组成的RNA剪切产物[4]。人工合成与靶标序列完全互补的由21个核苷酸组成的RNA双链,将其导入哺乳动物细胞内便可以清晰观察到RNAi效应[5],这些外源导入的双链RNA叫做siRNA。 由于上述RNA双链的剪切产物和内源性21至23个核苷酸长度的miRNA在结构上十分相似,于是研究人员针对其作进一步研究。结果他们发现miRNA同样具有基因沉默的功能[6~10],并且siRNA在基因沉默过程中与miRNA具有相同的机制,不过miRNA与其靶序列只是部分互补。由此,人们开始采用RNAi作为基因敲除的实验技术,有关miRNA及miRNA诱导的基因沉默现象也开始成为研究热点。目前,我们已经知道miRNA在很多重要的细胞功能,如在细胞增殖、分化、肿瘤生成、免疫功能以及其它功能中发挥着关键性作用。至于有哪些重要的生物过程有miRNA的参与则不在本综述的讨论范围之内,有兴趣的读者可以参阅文献[11]。本文的重点将集中于有关miRNA成熟机制研究及miRNA介导基因沉默方面的最新进展。

(I) miRNA生物合成

       截止到撰写本文时为止,研究人员已在人类基因组中发现并注释了500多种miRNA[12]。在基因组扫描和对发夹结构进行“系统发生性遮蔽(phylogenetic shadowing)”研究的基础上,研究人员预测人类基因组中至少存在1000种miRNA[13]。目前借助进一步发展的测序技术以及其它克隆技术的新进展,研究人员鉴别出越来越多的miRNA,而这恰恰证实了确实有超出我们预期的miRNA的存在[14,15]。大约有60%的miRNA位于基因间隔区(intergenic region),其余40%则位于蛋白编码基因或其它转录元件的内含子上[16~18,]。很多intergenic miRNA成簇分布,这样的miRNA有可能是在共同的启动子调控下表达的,因为它们具有相似的表达谱[18]。与上述情况相反,内含子miRNA(intronic miRNA)则更可能是在其所在基因的启动子下表达的,因为大多数intronic miRNA的表达与寄主mRNA的表达相似[18]。不过,也有一些例外,这暗示我们有些intronic miRNA具有独立的启动子[19]。

       接下来对intergenic miRNA的启动子进行阐述。大部分miRNA启动子需要募集RNA Pol II,且未显示出任何与蛋白编码基因不同的特性[20~23]。它们同样需要募集转录因子以进行时间及空间特异性的基因表达。miR-223就是其中一例,miR-223是一种单核细胞特异性miRNA,其启动子至少包含单核细胞特异性转录因子PU.1以及C/EBP功能性结合位点[24]。miR-146a则是由内毒素诱导而产生的miRNA,它的转录受自身启动子内NF-kB的结合位点调控[25]。另外,miR-375是β细胞特异性miRNA,它可反向调节胰岛素的分泌[26],这种位于斑马鱼β细胞内的miRNA在胰腺发育中具有重要作用[27]。据推测其miRNA编码区的上游和下游均有β细胞特异性转录因子Pdx1[28]的结合位点。

       miRNA通常由RNA Pol II转录,一般最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pri-miRNA[20,22]。这些pri-miRNA可长达几千个碱基。成熟miRNA序列通常仅位于构成发夹结构的其中一条链上(见图1A)。在哺乳动物细胞内,pri-miRNA在核内由“微处理器(microprocessor)”复合物进行处理,复合物由RNase III enzyme Drosha [29]、DGCR8 (DiGeorge critical region-8)及一个双链RNA结合蛋白[30,31,32]组成。Drosha从pri-miRNA发夹结构末端切下11个核苷酸,切割后的产物在3’端有两个碱基突出,在5’端为磷酸盐基团[29]。体外试验证实,microprocessor复合物可以从发夹结构上“量出”11个核苷酸,在单链RNA与发夹结构结合处将11个核苷酸组成的片段切下,切割后的65至75个核苷酸长度的茎环结构就叫做pre-miRNA(见图1C)。

       研究人员构建DGCR8基因的敲除小鼠模型[33]。与Dicer敲除小鼠[34]一样,纯合型DGCR8基因敲除小鼠胚胎在第6.5天可观察到异常,并在第12天时胚胎出现死亡进而被机体重新吸收。这一结果表明DGCR8乃至miRNA在机体发育过程中起着关键性的作用。DGCR8敲除的胚胎干细胞与未经敲除的干细胞相比,其倍增时间显著增长,并且对体外分化刺激没有反应,提示miRNA很可能在细胞增殖与分化中具有重要作用。与Dicer敲除胚胎干细胞相似[35],DGCR8敲除胚胎干细胞中缺失大部分成熟microRNA,这进一步证实DGCR8在大多数microRNA成熟过程中的重要作用。

                                                          

图1 miRNA、shRNA及siRNA的生物合成

(A) miRNA由基因组中某个基因座位转录生成具有5’端帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。之后在Drosha/DGCR8作用下加工成为pre-miRNA,再经Exportin-5转运至细胞质。pre-miRNA经过Dicer的进一步剪切形成成熟miRNA,miRNA再与RISC以不完全互补的方式结合。(B) 相反,shRNA则自外源导入的DNA转录为类似pre-miRNA的分子,因此不需经过Drosha/DGCR8的加工。之后,与miRNA一样,shRNA经Exportin-5转运至细胞质,在细胞质内经Dicer切割去除环状结构,双链中的一条以完全互补形式与RISC结合。(C) 对于哺乳动物,siRNA则由人工转染进入细胞质,然后与RISC结合。进一步的详细信息请参见文章。

       Mirtron(见文后小词典)是intronic microRNA中一个特别的类别,不需要经过microprocessor的剪切。Mirtron通过自身拼接反应形成pre-miRNA。通常经microprocessor的剪切而形成的pre-miRNA的末端是由剪接受体(splice acceptor)与供体位点(donor site)构成的。据此,从逻辑上讲,在mirtron的生物合成过程中,套索结构(lariat structure)的“解套”也是必需的[36,37]。研究者已经利用计算机鉴定出许多哺乳动物体内的mirtron,这些mirtron很明显是从果蝇和线虫体内的mirtron进化而来的[38]。与mirtron不同的是,即使寄主intronic的剪切因其自身剪切位点突变而受阻时,intronic miRNA仍然可以被有效加工,反过来讲,miRNA加工过程受抑也不会影响mRNA的剪切[39]。

       Pre-miRNA借助RanGTP依赖性Exportin-5,从核内转运至胞质[40,41]。在细胞质内,pre-miRNA经Dicer剪切,成为成熟的、大约21至23个核苷酸长度的链,Dicer是一种RNase III家族的酶[42]。Dicer与dsRNA分子相结合形成的晶体结构显示,Dicer PAZ(Piwi-Argonaute-Zwille)结构域是与dsRNA分子的末端相结合的,据此可以得知,RNase III酶结构域位于距离RNA双链末端大约25个核苷酸处[43]。与Drosha相同,Dicer切割后所得的RNA片段都有3’端两个碱基的突出和5’端的磷酸基团[42,44]。由于Dicer剪切位点由之前的Drosha剪切位点决定,因此可以说Drosha通过间接的方式决定了成熟miRNA的最终序列。

                                                           

图2 miRNA介导的转录后基因沉默多重机制

(A) 如果miRNA和靶基因完全配对,Ago2蛋白降解靶mRNA。(B) 通过阻断eIF4E和mRNA 5’端帽子结构之间的相互作用而造成的miRNA与靶基因间的不完全配对则最终导致翻译阻遏(C) 并导致翻译活跃的核糖体裂解或者(D)通过未知因子诱导mRNA去帽,或者去腺苷酸化。

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