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shRNA表达克隆

基因沉默机制

May 06, 2008 No Comments

(II)基因沉默机制

       在人类中,Dicer存在于由TRBP和Ago2组成的蛋白复合物中。pre-miRNA经Dicer剪切获得最终长度,这种双链RNA通过一种未知的解旋酶解旋,而其中一条RNA链与Ago2结合[45~47] (见图1)。与Ago2结合的链称为guide strand,它是成熟的miRNA(miR)。而另一条链称为passenger strand,它被认为由Ago2本身的剪切活性所降解[48~51]。选用哪条链似乎取决于RNA双链的5’或3’端的相对热力学稳定性:如果miRNA 5’端的碱基配对更不稳定,那么它就成为guide strand[52,53]。目前还不明确哺乳动物细胞选择链的类型的相关机制。果蝇中,RNA结合蛋白R2D2通过选择性地与末端稳定的双链结合来介导链的选择,从而直接指导RISC的定位[54]。目前还未能在哺乳动物中鉴定出R2D2同源物,R2D2仅在加工内源siRNA过程中扮演一定角色,而完全互补的RNA双链则由Dicer剪切长片段dsRNA而成。值得注意的是,在哺乳动物中还没有发现内源siRNA。

       最近,通过靶向破坏骨髓祖细胞[55]以及在小鼠胚胎成纤维细胞[56]中的Ago2基因,表明Ago2对正常miRNA的生物合成过程具有重要作用。有趣的是,Ago2的一种RNase突变体可以修复miRNA的生物合成,表明它没有阻断passenger strand的剪切过程。不过相关机制还有待进一步阐明。

       此外,研究人员在哺乳动物细胞内发现,pre-miRNA首先经由passenger strand中的Ago2剪切,然后才被Dicer剪切,这表明从Dicer剪切到passenger strand剪切的这一经典的miRNA加工顺序并非一成不变[56]。

       一旦miR与Ago2相结合,Dicer和TRBP就能够从复合物中解离[47]。与miRNA结合的Ago2有可能和其它众多蛋白组装形成RISC。一个具有功能的、最小的哺乳动物RISC可以只包含miRNA和Ago2[57]。虽然目前已知果蝇RISC的大小为80S并包含有核糖体元件,但是哺乳动物RISC的其它组成元件及其大小仍然有待进一步研究[58]。

       与miRNA相结合的RISC(在此我们不妨称之为miRISC)是如何引发基因沉默的呢?人们认为这似乎主要取决于miRNA与靶序列之间序列互补的程度。如果两者间完全互补配对,那么Ago2从miRNA 5’端起的第10个和第11个碱基开始剪切靶mRNA[59](见图2A)。与这个过程相关的一个例子就是miR-196a及其靶基因HoxB8之间除了出现单个G:U错配外,其余碱基都完全互补配对[60,61]。5’端的mRNA片段可能被核酸外切酶自3’→5’降解。然而,这些5’端的片段,也可能和无模板的多聚腺甘酸化(polyadenylation)或多聚尿甘酸化(polyuridylylation)相关,从而分别加剧3’→5’降解或造成脱帽[62,63]。

       如果是不完全互补配对(即大多数miRNA和靶基因的作用形式),miRISC就会引发翻译阻遏并破坏mRNA的稳定[6,8,64]。通过人工构建报告基因进行相关实验,研究人员发现翻译阻遏的水平和miRNA的结合位点数目呈正相关[65]。令人吃惊的是,miRNA诱导的基因沉默的同源关键区位于miRNA序列第2-8个核苷酸,或位于“seed”区[66]。RISC的关键催化亚基的结构——Ago2的结构——从分子水平揭示了seed区在miRNA诱导的翻译阻遏中扮演了重要的角色。miRNA 5’端的第2-8个核苷酸以A螺旋形式出现,以结合到靶标mRNA上,而3’端则和Ago2结合,所以miRNA与靶mRNA形成的RNA双螺旋结构并未大受人们推崇[67,68]。

       总之,对miRNA生物合成过程的研究揭示了一个复杂的合成通路:从特定的较大的基因组结构转变为能介导序列特异性沉默的短小的、细胞质单链miRNA。未来对miRNA生物合成的研究不仅要阐明其它参与基因沉默的元件组分,还需明确其自身生物合成的相关机制。

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