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shRNA表达克隆

miRNA的靶标

May 06, 2008 No Comments

(IV)miRNA的靶标

       尽管定位于5’ UTR的miRNA结合位点也能引起结构性蛋白合成抑制,但到目前为止,内源miRNA靶序列仅限于3’ UTR [79]。尽管靶序列预测的软件程序已预测存在潜在的位于哺乳动物开放阅读框(open reading frames, ORF)内[88]以及植物5’ UTR中的miRNA靶标,但是这些靶标并没有经过实验验证[89]。最初,寻找miRNA靶标的生物信息学方法是通过计算miRNA和靶序列之间的结合自由能来实现的。目前利用这些方法已经预测了上千个靶序列,但是假阳性的发生率极高。根据miRNA在3’ UTR结合位点的物种保守性以及UTR序列结合的多样性,靶序列预测程序的可靠性也在逐渐提高。然而,这些靶序列的实验验证进度要远远落后于这些预测,所以很难正确评估程序的准确性。利用一系列非特异性的,并已经鉴定了的小分子miRNA和它们的靶序列配对,结果显示,PicTar和TargetScanS这两种程序具有更好的敏感性,阳性率达到47%。由于假阳性率太高,很难估计序列的特异性。所以,只有经过大量的预测,才能得到高度的敏感性(大概每个miRNA预测300次),然而这就意味着特异性的降低[90]。

       种子配对序列获得miRNA靶向的机会并不都是平等的。通过转染15个不同的miRNA,并通过基因芯片分析它们对内源靶位点产生的效应,Grimson和他的同事已鉴定出一些新的特征以更好的预测miRNA靶序列。如果这些位点离终止密码子15个核苷酸以上的位置,在富含AU的区域,并具有一个8-40个核苷酸的另一个miRNA绑定结合位点,或者具有13-18个额外的碱基互补区域,那么它们就更为有效可靠[89]。很明显,miRNA的3’ UTR的二级结构对它的功能同样具有决定性作用。通过设计具有不同二级结构的靶序列,Ameres和Schroeder发现,已经和另一个RNA分子配对的靶序列没有被RISC有效的剪切[91]。Kertesz等人也进一步证实,对siRNA降解过程来说,mRNA的二级结构也是一个重要因素[92]。在果蝇中,他们利用内源miRNA和具有含有miRNA结合位点的荧光素酶受体证明了mRNA靶位点的单链型对miRNA介导的基因沉默是一个积极有效的预测因子。在实验证据的基础上,产生了一种新的计算机模型以便预测miRNA靶标,它以打开mRNA靶位点二级结构所需的自由能和使miRNA和靶标结合所需的自由能为基础。这个模型可以更好的预测miRNA靶位点,它比任何现有的程序都好,而且它不需要依赖序列保守性,这样可以提高特异性[92]。不过对于长序列来说,预测mRNA二级结构的程序算法,以及使二级结构产生变化的自由能的计算方法都还不够完善。

       事实上,许多靶标都是翻译调节的,所以用实验确定这些大量的靶标具有一定的挑战性,因此,似乎需要一种蛋白质组的方法去完全定位某一特定的microRNA靶标。在最初的方法中,研究人员敲除果蝇卵母细胞中的Dicer,随后他们发现在发育过程中,有4%的蛋白的产生被抑制[93]。通过无特异性的蛋白质组筛选程序,研究人员已经鉴定少量的miR-21和miR-378靶标。

       鉴定miRNA靶标的新方法涉及miRISC的分离以及鉴定靶mRNA,类似于通过染色质免疫沉淀反应鉴定转录因子中的靶启动子。Easow和他的同事们利用这种方法,在表达miR-1或者突变体miR-1的果蝇S2细胞中,鉴定了108个和miRISC 特异性结合的mRNA。其中32个有miR-1结合位点、11个和miR-1的seed sequence完全配对。通过荧光素酶连接构造,这11个3’ UTR已经被证实是这个miRNA的靶标。值得注意的是,这11个3’ UTR中,只有5个被生物信息学的方法预测出来,这和“现有的生物信息学算法程序不具有很好的敏感度”这一论点是一致的。

       此外,敲除一个miRNA基因可以为microRNA的功能提供权威性的证明,并也可以作为一个鉴定miRNA靶标的工具。不过,大部分研究依旧依赖于用基因芯片分析mRNA量的水平。到目前为止,miR-1-2(一个心脏特异性的microRNA)已经被证实对心脏的发育起着极其重要的作用[94],并且miR-155似乎对正常的免疫反应和免疫调节都具有重要作用[95,96]。最终,敲除休眠的成熟B细胞和T细胞中的miR-150,中度的抑制了c-myb(一种癌基因)的表达,这和生物信息学方法预测的靶标是一致的。此外,miR-150敲除的表型是一个c-Myb异形接合体[97]。作者指出,尽管一个特定miRNA可能具有非常多的靶标,但其中可能只有一小部分是生物学关联的。

       综上,miRNA潜在靶标的数量可能非常多,这为基因的表达提供精细的调节机制。如果没有相关的方法去检测蛋白质和mRNA表达水平的话,理解这种miRNA通路的复杂性就会非常困难。基于蛋白质组和基因芯片相关技术的应用将帮助我们尽力去完成这个领域的研究,但是如果利用无特异性的基因筛选,生物学相关的鉴定将得到加强。

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