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shRNA表达克隆

RNA干扰通路的控制

May 06, 2008 No Comments

(V)RNA干扰通路的控制

       尽管miRNA可以潜在地直接沉默成百上千个基因,而合成的RNAi诱导的基因沉默经常只作用于某一特定基因。这两种在哺乳动物细胞中常用的靶基因沉默方法,都是通过引入合成的siRNA或者shRNA。就像上面所提到的,在哺乳动物细胞中,通过与RISC的结合,siRNA的转染可以诱导特异性的基因沉默[5]。shRNA是siRNA的必须前体,它们被Dicer剪切成成熟的具有功能的siRNA (如图1B)。短发夹RNA由正义siRNA、环、反义siRNA序列组成,反义siRNA序列可以和靶序列互补。这些shRNA通常是从RNA Pol III启动子中表达的[81,98~103]。然后shRNA通过Exportin-5转运到细胞质,进而经Dicer剪切成成熟的siRNA,并进入miRNA通路。Pol II聚合产生的内源miRNA而引发的RNA干扰效应同样通过用一个特异性的发夹RNA代替内源miRNA[103]。以上所提到的方法的一个优点就是它们可以通过一个单一的启动子去产生多个shRNA。

       siRNA和 shRNA通常被设计来和它们的靶标进行完全配对互补,以指导mRNA基因的裂解。然而,如果另一个基因具有一个相似的seed sequence区域,siRNA 或者shRNA有可能会导致翻译阻遏或者像miRNA一样导致mRNA的不稳定[65]。事实上,通过基因芯片测量分析,发现siRNA和shRNA会导致大量脱靶转录的下调作用。这些转录产物可以直接作用于靶标,因为它们通常包含完美的seed sequence并可以和它们的3’ UTR配对[89,104~106]。一个科研小组的研究表明,如果引入2’-O-甲基基团到siRNA的2’位置,这些脱靶效应就会获得减缓[107]。通过降低和hAgo2的亲和力,这个修饰可以降低脱靶效应。值得注意的是,在这些研究中,脱靶效应被低估了,因为只估计了那些下调了的mRNA,遗漏了完全翻译沉默的mRNA。正是因为这些原因,在任何敲除实验中,或在用于确定靶序列特异性的时候(具体方法是:通过siRNA或者shRNA去确定那些具有不同seed sequence的基因),都应该考虑种子序列的互补导致的脱靶效应。

       因为siRNA的沉默效应需要内源RISC复合物,转染过多的siRNA可能会使有限的RISC饱和并抑制内源miRNA的功能。事实上,在人工受体系统中,转染两个不同的siRNA,当第二个siRNA被转染的时候可以观察到第一个siRNA对靶标的抑制效应被破坏[108]。通过人工受体监控,发现由于siRNA转染,内源miRNA的沉默效应同样遭到破坏。当 siRNA在一个miRNA过表达的脊椎中被表达的时候,没有观察到这种效应,具体原因还不明确[109]。

       因为shRNA需要依赖Exportin-5从细胞核到细胞质,并经过Dicer的加工,有人预测miRNA的加工机制通过shRNA的过表达而出现饱和现象。事实上,shRNA在细胞系中的表达可以减低miRNA诱导的对一个人造靶标的抑制效应,并且Exportin-5的过量表达可以恢复这种抑制效应[110]。在小鼠中也可以看到这种现象,当由腺病毒载体在肝脏中表达shRNA的时候,可以降低内源性的miR-122水平并导致肝脏缺陷[31]。这些研究表明,在体内,需要精确的用滴定法测量shRNA的表达水平,以减少非特异性的干扰。值得注意的是,当利用siRNA注射的时候,没有观察到竞争效应[111],这表明RISC自身可能是没有限制的。这些令人好奇的结果显示当利用RNAi途径去沉默目的基因的时候,应该考虑到其危险性,另外这些结果也表明脱靶效应和非特异性的毒性干扰是可以修复的。

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