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shRNA表达克隆

不可思议的机制

May 06, 2008 No Comments

       RNA干扰(RNA interference, RNAi)是一种由短双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)所引起的序列特异性基因沉默,是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一,它与协同抑制(cosuppression)、转座子沉默(transposon silencing)以及发育等许多重要生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)与靶序列之间严格的碱基配对,具有很强的特异性,涉及众多基因和蛋白复合物,构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统,它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节[1]。

       人们把RNAi称作“过去20年来生物学最令人兴奋的一个发现”。自1998年Andrew Fire等首次发现这个机制以来,它已迅速成为分子生物学最有效和必不可少的技术工具。通过dsRNA分子,RNAi可以选择性地沉默基因组中任何一个基因。它是在真核生物(与酵母和哺乳动物一样,品种繁多)中发现的基因调控的一种古老机制,此外,它在所有真核生物的基因表达调控中扮演着非常重要的角色。实验室中,RNAi可以揭示发育、细胞内信号传导、癌症、侵染等其它生命现象的基因秘密。但是,人们在为2002年《科学》(Science)杂志上发表的题为“年度重大技术成就”的文章的欢呼过后,不禁思考:究竟RNAi技术能不能走出实验室,并最终应用于临床治疗呢?大型医药公司当然希望RNAi能应用于药物治疗,一些生物技术公司也致力开展相关研究,并且把公司前途压在这个项目上面,但是并不是所有人都对RNAi治疗的前景持乐观态度。

       人们认为RNAi可以作为强而有效的治疗药物主要是因为它具有敏锐的选择性:就像传说中的“魔法子弹”一样,RNAi序列能够寻找并破坏靶基因,但不会给正常基因带来任何不良影响。另外,它的临床应用前景似乎无限开阔:与疾病(包括从病毒基因到肿瘤基因再到与心脏病、老年痴呆症、糖尿病等)相关的任何基因都可以作为潜在的RNAi靶标。尽管RNAi前途光明,但想要进入临床研究领域,还要走很长的一段路。尽管它的实验效果显著,但目前还没有对人类开展相关研究,只以动物为对象进行类似实验,并取得一些进展。除了RNAi之外,其它两种基于RNA的疗法——反义药物(antisense)和核酶药物(ribozyme)在通往临床治疗的道路上也充斥着希望与失败。RNAi是否会面临同样的困境?还是它与众不同,一鸣惊人?

(I)不可思议的机制

       要成为一种高效药物,RNAi就必须克服一系列障碍。首先,药物制造的费用要合理,药物的使用必须安全、方便;其次(也是更为重要的一点),在被降解或排出体外之前,药物必须保持稳定的结构,直到能顺利到达靶细胞。RNAi药物必须进入靶细胞,并与细胞内靶标连接起来,发挥自身作用;此外,它还必须发挥足够的药效,改善服食药物的病人的身体状况。最后,RNAi还不能对靶细胞或其它正常组织带来任何毒副作用。不管一种化合物在实验室显示出多好的治疗效果,如果它不能达到要求,它就没有任何药用价值了。

       对于基于RNA的疗法来说,药物制造是没有任何难度的,但药物分子传递、稳定性和药效却是最难克服的瓶颈之处。美国生物技术公司Sirna Therapeutics研究与发展部Nassim Usman指出:“在市场利益驱使下,很多化合物未经研究成熟就便被应用于临床医学。”Sirna是以核酶药物起家的生物技术公司,它试图把核酶发展成能治疗几种疾病,包括丙型肝炎的药物。核酶是一种RNA分子,它的序列和结构使得它能够剪切特定的靶RNA分子。Usman指出,起初核酶治疗丙型肝炎的效果并不理想,因为这种分子药效低,一旦进入体内,它们的半衰期就会缩短。即使使用“巨大的剂量”,也无法对病毒负荷量造成明显的影响。他指出:“核酶只是不具备成为药物的特质”。截至本文定稿,美国食物药物管理局(United States Food and Drug Administration, FDA)还没有批准任何核酶药物。

       同样,尽管在反义药物发展的早期,人们热情高涨,但后来却失望而归。反义链可以是单链RNA或DNA,与靶标信使RNA(mRNA)序列互补;通过与mRNA配对,反义链阻碍mRNA的翻译。早期临床结果似乎都支持这样一个理论:抗癌实验中,反义药物能有效的令肿瘤变小;而在抗病毒实验中,它能减少病毒负荷量。但更进一步的检验表明,出现以上结果的主要原因是免疫系统面对高剂量的外源RNA(而不是任何靶基因的特定沉默),产生了更多的干扰素。(反义药物中比例相对较高的C-G序列模仿细菌和病毒基因,因此诱发了免疫反应。)当降低反义药物剂量,从而妨碍干扰素反应,临床效力也会大范围下降。因此,与其说是高特异性疗法,反义药物似乎只是一般的免疫系统促进剂。

       但既然病人病情逐渐好转,还有必要了解相关的药物治疗机制吗?哥伦比亚大学(Columbia University)医学和药物学副教授CyStein表示:“如果你是病人,你可以不了解药物的治疗机制,但如果你正尝试开发下一种药物,这就显得尤为重要了”。Stein研究反义药物已超过10年。“一旦你弄错药物机制,你就无法继续下一步研究了”。

       到目前为止,FDA只批准了一种反义药物——Vitravene。它由美国加州Isis Pharmaceuticals公司研制而成。Vitravene可以用于治疗眼部被巨细胞病毒侵染的HIV病人。Usman指出,尽管Vitravene是一种与病毒DNA相结合的DNA反义药物,但“还不是很清楚它是否依赖反义机制运作”。同样,Stein也对第二种反义药物Genasense的机制表示怀疑。Genasense是一种以DNA为基础的疗法,它以Bcl-2(一种在癌症细胞里高度表达的蛋白,它能够保护癌症细胞免受标准化疗法的伤害)为靶标。FDA目前正观察Genasense的应用,并评估它对恶性黑色素瘤的治疗前景。

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