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4.2 寻找具有诊断意义的蛋白生物标志物

Oct 14, 2008 No Comments

4.2 寻找具有诊断意义的蛋白生物标志物

当蛋白质组学研究人员开始采用高通量技术不断发现疾病生物标志物时,基础科学领域的科学家和仪器设备制造商却仍然致力于证明这一新型检测方法的可靠性。                                                

1896年,约翰•霍普金斯医院(John Hopkins Hospital)的管理层购买了一套特殊的设备,用来培养微生物、检查组织标本以及分析体液样品。他们将这套设备塞进一间只有12平方英尺的小房里。建立这间实验室的所有花费仅为50美元。

尽管建立一间临床实验室需要不断增添昂贵的设备和受过专业培训的技术人员,但实验室所带来的好处还是远远超过了这些花费。由于临床实验室的存在,医生可以确切知道病人的问题所在,而且得以尽可能地在疾病早期发现问题。

然而,像许多技术革新一样,临床实验检测同样很快到达了发展的平台期。即使在今天,还很难确诊多种致死性疾病。当然,如果病人罹患的是白喉或甲状腺疾病,医护人员很容易就能诊断出来;但是,如果病人不幸罹患癌症或阿尔茨海默氏病,要想进行准确的早期诊断,就十分困难了,大部分这类疾病都是在晚期才获得确诊。

目前,在新型分子实验设备、精密技术的不断涌现以及蛋白质组学飞速发展的促进下,部分研究人员正致力于采用蛋白生物标志物解决上述棘手问题。从理论上说,疾病早期,机体细胞内各种蛋白的表达水平就会发生一定改变,检测蛋白表达谱的改变可以更加快速和准确地诊断疾病。但是把这种理论转变为现实可操作的检测项目并非容易的事情,不过最近所取得的工作成果证明,至少这种转变还是有可能的。

“更少”可能是“更多”

加拿大蒙特利尔大学(University of Montreal)药学院的副教授Martin Latterich指出,新型检测策略与以往临床实验所采用的策略有着明显的不同。传统方法侧重于病理机制,所以检测项目也以其机制为基础。随着高通量技术的来临,部分研究人员开始通过将病人全蛋白组与正常人的全蛋白组进行比较,从而诊断相应疾病。

如上所述,既然从如此宏观的角度检测疾病,科研人员当然会发现一些直接参与致病过程的蛋白变化。但此外,他们还发现了许多替代性生物标志物(surrogate biomarker)。对高通量生物标志物分子检测技术持批评态度的人认为这种“撒大网”式的检测方法缺乏传统机制研究中所具有的科学严谨性。Latterich对此作出了回应,他在2005年发表的一篇社论(Proteome Sci. 3:8, October 28, 2005)中阐述了自己的观点:机制研究与高通量研究互补,生物学家应该认识到,在有些时候,“少即是多”的道理。

马里兰州国立癌症研究所(NCI)蛋白质组学和分析技术实验室主任SAIC-Frederick表示,现代生物标志物分子筛选技术的另一个问题是大量假阳性的存在。他指出,在进行相关实验时,人们确实处于盲目的状态,不知道会获得何种生物标志物。

实际上,许多研究生物标志物的研究人员都提到验证是该领域的最大难题,即如何从现有的大量候选生物标志物中缩小范围进一步筛选,最终获得少量几个真正有用的生物标志物的过程。对于Veenstra来说,他的实验室着重研究前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌的生物标志物,第一个问题就是如何从数百个表达发生变化的蛋白中初步筛选出真正有价值、值得继续追踪的几个分子。

即使排除了干扰分子,研究人员还必须开发更加有效且更具重复性的实验方法。Veenstra指出,验证过程确实需要多部门协作,比如发现分子的实验室和重点研究抗体或酶联免疫吸附(ELISA)的实验室之间就需要有效合作。ELISA是临床实验室中检测蛋白的标准方法,但进行一项新型ELISA实验可能需要数月时间。研究人员要验证更多的候选生物标志物,就必须进行更加多的实验。

为了更好地突破这一瓶颈,实验仪器制造商开始改良沿用了数十年的旧式ELISA方法。Perkin Elmer的以独有的抗体结合磁珠系统(antibody-binding bead system)为基础的AlphaLISA系统有着非常好的应用前景。AlphaLISA系统去掉了标准ELISA中严格的洗涤步骤。此外,整个检测过程更容易实现自动化程序。其中,后一项优势将会是一个非常好的卖点,因为基于多种生物标志物筛选的检测项目,开始逐步进入原本已经超负荷运转的临床实验室。

实际上,第一个基于蛋白质组学的临床检验项目即将出现。制药公司和临床检验公司都对此项目表示了高度的热情,即便验证过程和实验过程将会非常昂贵,他们仍然愿意投资这个新一代的项目——生物标志物。获悉NCI的研究人员发现蛋白表达谱与卵巢癌的预后有关后,马里兰州Rockville市的临床实验公司Correlogic Systems快速跟进了这个项目。他们最终获得的生物标志物名为OvaCheck,不过目前还处于最后的调试阶段,专家们似乎都对此类产品最终走向市场充满信心。同时,为了使他的员工能跟上这种技术的步伐,FDA已经开始从各家公司征集蛋白质组学数据,因为新的基于蛋白质组学的检测产品已经开始进入调试阶段了。

芯片、滤柱还是凝胶?

虽然越来越多制药公司和诊断公司开始采用传统的方法,例如ELISA来验证生物标志物,但更多公司坚信,还有更好的解决方案。德国Protagen公司的研究人员目前正用蛋白质芯片来筛选自身抗体的生物标志物。在一个典型实验中,科研人员用病人的血清和载有人类重组蛋白的实验板进行反应。这些重组蛋白代表的是胎儿脑组织的蛋白质组。该公司的CEO Christoph Huels说道:“我们用包含有10000种蛋白质分子的实验板来筛选病人血清,发现了一种特别的自身抗体识别模式,这种模式可用于疾病诊断。”

Huels还提到,运用蛋白质生物芯片诊断多发性硬化(MS)可以达到超过80%的敏感性和特异性。

用芯片系统来发现和验证生物标志物分子,有助于将这种检测方法快速应用于临床,但当然也存在相应的缺点。例如,芯片只能检测自身抗体,并且被检测的靶抗原必须是公司实验板中存在的重组蛋白质。

但无论如何,Huels强调,该芯片系统将会比预期有着更广泛的用途。一开始,它也许只能用于自身免疫疾病的相关检测。但到目前为止,该芯片系统在他们所检测的所有疾病中都是有效的。除了多发性硬化,Protagen公司还发现了阿尔茨海默氏病和前列腺癌的特异性自身抗体谱,研究人员还确认了秃发症和扩张性心肌病的检测目标。

Protagen公司目前侧重于药物开发计划,但他们并不是唯一一家研究抗体芯片筛选的公司。那些想从货架上购买该技术的科研人员可以直接致电Invitrogen公司,该公司的蛋白质组检测产品可以提供数种自身抗体检测芯片。这些芯片一次能检测多达8000种蛋白质,并且每次只需仅仅1微升血清或血浆作为检测样品。

可是对于许多仪器制造商和基础研究人员来说,生物标志物的发现还是集中于传统的实验技术之上,特别是液相色谱和质谱分析技术。值得庆幸的是这些技术近年来得到了飞速的发展(见《高通量质谱分析》,Science 319:1115, 2008),公司也开发了新型设备,专门用于发现生物标志物。

筛选生物标志物的其中一个问题就是从血清或其它生物体液中去除掉大部分的常见蛋白,以检测更罕见、信息量更大的蛋白信号,这些蛋白信号可能就是优秀的生物标志物。多个研究团体都倾向于用免疫耗竭柱(immunodepletion column)来进行这一步骤, Bio-Rad公司近来开发出了一个新产品——ProteoMiner。

Aran Paulus是公司蛋白质组学研究和发展部经理,他指出,Bio-Rad公司将结合在柱子上的抗体换成许多不同的六肽,于是构成了一个化学合成物的组合文库。大部分血清蛋白都至少与柱子中的一种六肽结合,但一旦六肽饱和,过量的蛋白就会被冲洗掉。待柱子被冲洗过后,研究人员再洗脱出结合到柱子上的蛋白,这些蛋白的浓度范围小得多。按照公司的说法,普通的蛋白都会被洗掉,但罕见的蛋白则仍然存留于柱上。

不论研究人员开始准备样品时采用何种策略,在进行质谱分析前通常都必需对样品进行额外的纯化工作。对许多现代生物标志物筛选过程来说,这意味着需要纳米级的高分辨率液相色谱系统,该系统通常直接连接质谱分析仪。不难想象,仪器制造商正在努力改进现有的仪器。

目前一种新策略正在改变常规的纳米级系统。常规的纳米级系统采用分流技术获得正确的流速,而新策略则采用微液体泵和反馈机制来调节流速。Remco van Soest是加利福尼亚州都柏林Eksigent Technologies公司的生产经理,他强调:“我们的技术可以让你获得从50纳升/分钟至300纳升/分钟流速的液体而无需采用分流技术,并且有着优异的重复性。”质谱分析仪通常是蛋白质组学试验中的终点,但一些生物标志物的研究仍然采用一种古老的技术进行最初的分离,这种技术就是2-D凝胶电泳技术。实际上对于许多生物化学家来说,2-D凝胶电泳就像虚构的摇滚乐队——“Spinal Tap”一样,尽管批评家和公众都不喜欢它,但它们仍然无法被替代。

对那些不在乎工作量的研究人员来说,相比色谱技术,2-D凝胶电泳在蛋白质组学的研究中具有自身独特的优势。凝胶保留了蛋白翻译后的修饰,这对于生物标志物研究来说非常重要,因为许多疾病会扰乱蛋白的糖基化作用或修饰作用。相比传统液相色谱,2-D凝胶电泳的分辨率要高得多,并且一次跑胶就可以分离数千个蛋白。目前没有其它色谱技术可以达到这种分离效果,2-D凝胶电泳的分辨率简直无可匹敌。

可购买的实验支持

只要想一想生物标志物研究的复杂性,就一点不会惊讶于为何如此多药物生产公司甚至一些基础研究人员另外雇用实验人员工作。实际上,随着生物标志物不断被发现,越来越多公司开始抢占市场。他们提供全套服务,从偶尔帮助进行2-D凝胶电泳至完整的发现并验证生物标志物。

是英国NextGen Sciences公司的CEOMike Pisano表示,他们可以独立、完整地进行这项研究。就像其它公司一样,NextGen sciences公司之所以转向生物标志相关业务是为了满足客户的需求。

刚开始,NextGen Sciences公司企图做实验室自动化,但生物标志物筛选业务的上升让它有能力收购Pisano的公司(一家提供蛋白质组学研究服务——专注于蛋白纯化服务的公司,位于密歇根州的Ann Arbor)。现在生物标志物业务已经成了集团的主营业务。Pisano指出,他们开发了临床标本蛋白定量检测,并且他们所发现的蛋白正是临床试验中制药公司非常感兴趣的蛋白,或是在临床前期公司非常希望获得的动物模型或石蜡油包埋组织中的蛋白。”

蒙特尔大学副教授Martin Latterich提到,为了获得有用结论,研究人员必须将病人分类,并将分类结果和疾病预后或选择何种治疗方式联系起来。当然,想要装备下一代临床实验室从而分析相应种类,花费肯定要超出50美元。

原文检索:www.sciencemag.org/

筱玥/编译

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