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shRNA表达克隆

二、传统的DNA测序技术——Sanger测序法

Oct 22, 2009 1 Comment

自上世纪90年代初,所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法(图1a)。而后来出现的高通量测序方法则首先采用以下两种方法中的一种对DNA进行预处理(表1)。

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无论采用以上哪种方法处理后,我们均可以得到大量的待测序模板片段——质粒或PCR产物。随后,测序仪会进行“循环测序”反应。在每一轮测序反应的引物延伸步骤中,会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的ddNTP(ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP)以终止延伸反应。这样就形成了大量末端被荧光标记的、长短不一(终止位点不同)的延伸产物。接着,再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物,通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分,计算机软件会自动“读出”DNA序列。不过,该方法在“读取”每一个碱基信息时都有可能出错。后续操作中,比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解决了。一般,这种高通量测序仪一次最多只能同时进行96个或384个样品测序。

Sanger DNA测序技术经过了30年的不断发展与完善,现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了,而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。在高通量基因组鸟枪法测序操作当中,使用Sanger测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。

原文检索:Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10):1135-1145.

YORK/编译

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One Response to “二、传统的DNA测序技术——Sanger测序法”

  1. 玲珑秋月 says:

    挺好!想多多了解前沿知识

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