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shRNA表达克隆

三、产生诱导性多能干细胞的指导方针和技术

Nov 24, 2009 No Comments

直接将体细胞重编程为多能干细胞为再生医学提供了极其宝贵的资源,它使得用非胚胎材料获得病人特异的任何谱系的细胞成为可能。虽然现行的获得诱导性多能干细胞的方法各异,但其核心都依赖于一组经选择的转录因子。这篇文章比较了目前所有文献报道的方法流程,确定了这些流程中必要的共同步骤,并推荐定义完全重编程细胞的最低标准。此外,还列举了一些旨在优化iPSC过程可重复性的特殊的处理方式,重点强调了对某些参数的标准化以方便对不同的独立实验进行精确的比较。

由成体分化细胞诱导而来的多能干细胞具有广阔的应用前景,尤其是在体外疾病模型、药物筛选、细胞取代治疗等领域。此外,将体细胞回复为胚胎干细胞的这种技术为探索由一种细胞类型转换成另一种细胞类型的分子机制提供了独特的手段。

先前设计的多能性诱导策略,比如体细胞核转移(克隆)或者体细胞与胚胎干细胞(ESC)融合,都遇到到技术、伦理和材料保障上的障碍,从而阻碍了这些多能性细胞在理论研究和治疗上的应用。因此,采用非胚胎材料直接产生多能性干细胞被认为是一个更为恰当的策略。这种策略更有利于机制的分析,而且也不会牵涉过多的伦理问题。

直接将体细胞重编程为胚胎干细胞的技术完成于2006年。Takahashi和Yamanaka通过外源表达一组选择性的转录因子将成体小鼠成纤维细胞逆转为诱导性多能干细胞(iPSCs)。后续的报道优化了这一技术,同时通过一组严格的分析,证明iPSCs事实上与胚胎干细胞(ESCs)极其类似。2007年,直接重编程在人类细胞中取得成功,为再生医学做出了无法估量的贡献。

尽管iPSCs细胞系的建立在概念和技术上都很简单,直接重编程依旧是一个包含大量未知事件的缓慢而低效的过程。为了可重复的获得iPSCs,几个可变因素必须考虑,包括:1、选择用于重编程细胞的因子;2、运送这些因子的方法;3、靶细胞类型的选择;4、重编程因子的表达参数,比如表达持续时间和水平;5、获取iPSCs的培养条件;6、识别;7、鉴定重编程细胞的方法。这篇综述将详细的讨论以上的每一个环节,并将结果概括在图8里。此外还包括一个重编程效率的讨论,目的是为了推动计算和效率报道的标准化。

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1. 重编程因子的选择

直接重编程最初通过在小鼠成纤维细胞中用逆转录病毒转导24个候选基因完成,这些候选基因都与多能性的确立和维持相关。最终发现这个24基因的小库只要缩减到四个转录因子Oct4(Pou5f1)、Sox2、c-Myc、Klf4就足以介导重编程。这组核心的转录因子后来被证明在多种小鼠细胞、恒河猴及人的细胞中均能介导重编程。

后来,各种不同的四因子鸡尾酒都被成功的用于体细胞的重编程。在小鼠的成纤维细胞中,Sox1和Sox3能取代Sox2,尽管伴随着一定程度的重编程效率的降低;Klf2能取代Klf4;L-Myc和N-Myc能取代c-Myc。同时一组部分不同的转录因子组合OCT4、SOX2、NANOG和LIN28,也被报道称足以重编程人的成纤维细胞。

不同细胞中某种重编程因子的内源性表达可使该因子在上述鸡尾酒配方中缺席。例如,成纤维细胞表达c-Myc和Klf4,后来证明外源性的c-Myc在重编程小鼠和人的成纤维细胞过程中不是必须的,尽管重编程效率更低并需要更长的时间。神经前体细胞表达比ES细胞具有更高水平的Sox2和c-Myc,结果证明仅需要Oct4/Klf4或Oct4/c-Myc就可以重编程,尽管效率比采用四因子时低。

尽管最初的四因子依旧是重编程的标准因子,后来有报导发现少数的几个小分子和额外的因子能提高重编程效率或在功能上取代某种标准因子(表4)。这种介导物的存在为重编程发生的机制提供了新的见解,大量类似的研究也可能即将展开。使用小分子和可溶性因子的独特魅力在于它们运用方便的同时不会对基因组造成永久性修饰,而这种基因组的改变正是采用逆转率病毒或慢病毒的局限性所在。然而,现在还不清楚小分子是否可以囊括由四因子带来的转录和表观遗传学的一系列改变。对越来越多表观遗传学修饰物使用的一个重要的忠告在于它们广泛的或非特异性的作用可能会引起基因组整体表达的紊乱。比如5-胞氮核苷是一个诱变剂,会因小鼠全基因组DNA甲基化水平的改变而导致高频率的肿瘤产生。总体上讲,可供选择及有辅助作用的因子数量正在上升,而新的方法必须经过严格的测试才能确保最终产生的iPSCs细胞系的质量。

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注:O,Oct4 ;S,Sox2;M,c-Myc;K,Klf4;Dnmt1,DNA methyltransferase 1;

2. 重编程因子运载系统

迄今为止,iPSCs的产生均通过重编程因子的核酸运载系统获得。最初小鼠和人的iPSCs产生采用的是逆转录病毒载体和组成型的慢病毒载体,而后来则采用可诱导的慢病毒载体。然而,这些病毒系统因其会永久整合进基因组而受到质疑。为了使得iPSCs更具治疗的可适性,必须追求非整合的方法(表5)。两套这样的方案,即腺病毒转运和瞬时转染,已经成功运用于小鼠细胞的重编程,使得最终运用瞬时转运方法获取人的iPSCs成为可能。

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最初的直接重编程尝试采用的是基于莫洛尼氏白血病病毒改造的逆转录病毒载体,这种载体在干细胞中处于沉默状态。这种自我沉默的特性为初期重编程的尝试提供了便利,因为那时对外源转录因子表达时间的需要尚不明确。然而,除基因组整合以外的几个缺陷阻碍了这些病毒的应用(表6)。

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尽管慢病毒可感染非分裂的细胞并维持高水平的外源表达,但其在多能性细胞状态下的沉默却不尽人意,这种持续的翻译表达在重编程的尝试中不大可取。尽管采用持续表达的慢病毒载体诱导iPSCs已经有报道,但不清楚在转基因持续表达状态下细胞如何进行分化。

药物诱导的慢病毒系统提供了一种更有吸引力的方案,因为它可对重编程因子表达水平进行即时控制。尽管这些病毒也整合进宿主细胞的基因组,但不可否认它们特别适合应用于机理研究。例如,由于使用了这种病毒,所以出现了“第二次iPS系统(Secondary iPS system)”的出现。在这个系统中,由iPSCs分化来的细胞拥有同样的由初次诱导的iPSCs所赋予的原病毒整合位点。通过再次诱导,病毒携带的转录因子被均匀的重新激活,导致二次iPSCs效率较先前增加了100倍以上。这个系统为在化学和遗传水平上筛选促进重编程的因子及优化iPSCs形成条件提供了一个强有力的工具。基于这种方法可能建立的新技术包括定位重编程因子DNA在基因组上的位置以用于排除随机整合的位置效应,将四种重编程因子连在一个转录本上以有利于这种靶标作用。

整合型病毒的使用是妨碍iPSC走向临床相关应用的主要障碍,因为有迹象表明基因组的插入可能影响基因功能,而病毒基因的重新激活则会导致肿瘤发生。对整合位点的分析没有发现共同的靶标和通路,这表明重编程过程中基因组的整合并非必须。用瞬时转染方法成功获得了小鼠iPSC进一步证明了这一观点,同时也为优化人的iPSC技术提供了坚实的基础。

3. 细胞类型的选择

最初在小鼠和人细胞的重编程尝试中,成纤维细胞被当作起始细胞群。成体成纤维细胞之前被证明可以在小鼠中通过核移植重编程,小鼠和人细胞均可通过细胞融合重编程。另外,分离成纤维细胞在技术上十分简便,而病人特异的成纤维细胞通过像coriell这样的细胞库也可以很方便的获取。成纤维细胞不仅可以与胚胎干细胞的培养条件兼容,还可以用作胚胎干细胞生长的饲养层细胞,所有这些都让它成为进行直接重编程操作比较切实可行的初始候选细胞群。

自成功重编程成纤维细胞以来,多种小鼠细胞类型包括胃细胞、肝细胞、胰腺β细胞、淋巴细胞、神经前体细胞及人的角质细胞都被成功地重编程。多数这样的实验都采用了遗传标记或其它相关技术来确定供体细胞来源,从而排除了被原有成纤维细胞污染的可能。

在这些研究中有一个事实浮出水面,细胞类型强烈影响着重编程,包括重编程效率、动力学过程以及重编程因子导入的难易。例如,在重编程小鼠胃和肝细胞的过程中,干细胞特异表达的Fbx15基因的激活比在成纤维细胞中快的多,同时含有更少的病毒整合位点。人的角质细胞比人的成纤维细胞重编程更快更高效。在给定的细胞类型中,重编程因子的有效运送也起着很重要的作用。用腺病毒载体重编程小鼠的成纤维细胞需要的病毒滴度,比重编程肝细胞所需要的病毒滴度高出100到200倍。在一个给定的应用中要选用最佳的细胞类型必须考虑到以下几个方面:1)采用哪些简便的重编程因子;2)给定细胞类型的可能性和简便性;3)细胞的代数和来源。衰老细胞或经过若干次传代培养的细胞可能包含遗传上的损伤,从而会损害最终获取的iPSCs的治疗潜能。同样的道理,来源于不同组织的细胞有可能存在DNA损伤,比如皮肤细胞更有可能积累了紫外线诱导的突变,因此不大适合作为临床应用的供体细胞。总体说来,成纤维细胞依旧是研究重编程过程机制时基础研究的首选,而用于应用研究的iPSCs则需要供体细胞容易获取、含有较少的遗传紊乱以及容易被瞬时转染方法重编程。

4. 表达因子的参数

向非整合运送策略的转移对于更好的理解转录因子间是如何协调完成重编程是非常必要的。为了改进iPSCs的获取过程,详细地说明转录因子的即时需要,最优的因子水平和剂量就变得十分重要。另外,重编程因子运送的量化对探究这些信息十分关键,同时也可确保实验的重复性,以方便在独立的不同实验之间进行比较。

细胞不依赖重编程因子外源表达所需的时间长度已经通过采用Dox诱导系统解决。在小鼠的成纤维细胞中,重编程因子需求的动力学已经被量化,重编程过程至少需要重编程因子持续作用8-12天。在人的角质细胞中则大约需要10天。尽管将外源重编程因子的表达时间延长到超过最低限度时间可以提高克隆得率,但是持续的外源因子表达也可能对多能性造成损害。因此,一个大概的指导方针是一旦出现真正的iPSCs外源表达时就必须终止(在方法与重编程细胞的鉴定中将详细讨论)。在所有的已知案例中,尽管重编程的动力学受初始细胞类型的高度影响,重编程都需要经历好几天时间才能完成。目前所有已报道的细胞类型资料表明,细胞状态是除细胞类型外影响动力学的另一个原因。这最可能是由于分化因子所导致,但也可能是由于细胞内在的不同,比如细胞周期状态、分化状态和代数。

重编程过程对重编程因子所需要的精确的表达水平和剂量是很难检测的。重编程因子运载系统的多样性加上逆分化的低效率,使得很难详细分析每个重编程因子在致使单个分化细胞获取多能性过程中的作用。然而达到最优的表达水平对重编程相当重要,例如把Sox2从四因子的鸡尾酒配方中去掉后,将神经前体细胞逆转为iPSCs的效率会更高。这表明,外源驱动的Sox2表达再加上高水平的内源表达对重编程是有害的。二次系统的建立为探索单独重编程因子的精确作用提供了一个更加可靠的工具,在这个系统中,每个克隆具有同一个独特而可信的重编程因子激活方式。

尽管重编程因子的最佳表达水平和剂量还没有得到很好的阐述,但必须承认细胞接受所有重编程因子在完成重编程的过程中是非常重要的一步,在一定的运载系统中量化单个因子的表达水平对可重复性的获取iPSCs也十分关键。目前还没有报道对所运送的因子进行彻底的量化。在大多数例子中,这些都是通过单独运送报告因子间接的给予解决,比如编码GFP的载体。然而,这些替代指示物的使用提供的是一个不准确的结果。比如,报告蛋白拥有较长的半衰期而变得相当稳定,此外这些蛋白质没有经过与转录因子同样的细胞内加工。这些区别部分反映在瞬时运载策略中。在这种策略中需要多重运用重编程因子,而且每个因子重复运用的时间与每个因子表达时间长短相关。在基于病毒载体的方案中,滴度会受到目的基因的影响,因为在包装过程中基因产物高水平的表达,将很有可能改变包装细胞的功能。因此,即便采用固定的转染参数,病毒的滴度仍然是极易改变的。最佳的量化方式是在目的细胞中直接对表达水平进行分析。这种分析可以通过采用连接报告基因来完成,比如使用IRES-GFP或通过免疫染色。这些方法的优点在于都可以进行单细胞水平的分析。对重编程因子更加精确的测量可通过评估共感染效率来测定接受所有因子细胞的比例。尽管测试每批产物中每种因子的表达量需要相当大的工作量,但这可以在实验的重复性上获得高回报。此外,对各个因子输入量的控制将有利于不同运载方案之间的转换。

由于基于病毒基因的运载方法在iPSCs的制备中仍然很受欢迎,产生高滴度病毒的能力就变得尤其重要。详细的专门针对iPSCs制备的实验流程提供了一个很好的起始资源。尽管仅局限于逆转录病毒,这些基本的实验流程具有极高的可适性,可以应用于其它不同形式转运系统的优化。其它更大范围的与病毒方法有关的综述也可作为参考。一种可供选择的思路是将病毒生产商业化。这对应用来讲将更加合适,因为应用追求的是获取iPSCs后的下游分析,而不是获得iPSCs过程中手段的灵活性。

5. 培养和分离条件

小鼠和人iPSCs的分离过程是在维持胚胎干细胞的培养条件下进行的。在此过程中必须确保这种具有选择性的条件支持胚胎干细胞的生长。尽管可供选择的重编程培养条件还没有被报道。但创造一个确定的、无动物源的培养条件将对建立更适应于临床应用的iPSCs起到推动作用。

尽管按照胚胎干细胞的培养条件足以从多种细胞类型中获取iPSCs,但推测认为利于分离胚胎干细胞的培养条件也会增强iPSCs的分离。比如采用血清替代物(KOSR)代替血清极大的促进了胚胎干细胞的分离,同时这种培养条件也被报道可以促进重编程。血清替代物的使用为多种不适合采用标准的血清重编程的细胞类型提供了一个可供选择的重编程培养条件。然而,值得重点强调的是,采用成分不明确的培养基(比如血清)会导致批次之间差异,可能会引起重复性差的效果。因此筛选不同批次的血清对胚胎干细胞的支持能力变得十分重要。胚胎干细胞依赖成纤维细胞分泌的细胞因子来支持它们的生长,尤其是人的胚胎干细胞(hESCs)。小鼠的胚胎干细胞可以在凝胶包被、无饲养层细胞及添加额外生长因子的条件下分离和培养。同样,小鼠的iPSCs也可以在无饲养层条件下分离。尽管成分确定的人胚胎干细胞培养条件已经建立,但在无饲养层条件下分离人的iPSCs还没有被报道过,尽管这一直是临床上避免使用动物源产品的目标。

创造合适的分离条件很重要的方面在于取得最优的细胞密度。细胞种植在低密度的培养条件下可能很快衰老而变得不太容易重编程,而细胞种植在高密度的条件下则会很快达到过饱和而阻碍新的克隆的形成,同时还会引起细胞层飘起的风险,尤其是在重编程所需要的漫长的培养时段后期。这种风险已经在高效的第二次系统中得到阐明。在高密度条件下,尽管表达同等的重编程因子,克隆形成率会下降,这表明细胞密度与重编程效率之间是一种非线性的关系。尽管最优的细胞密度有待实验的进一步证实,但一个大概可依照的参考是感染后的细胞种植密度约10%,饲养层细胞密度不超过2.5万到5万每平方厘米为宜。
确定非成纤维细胞重编程培养条件的特殊性在于其必须同时满足供体细胞和产生的iPSCs的需要。因此,必须在供体细胞原初环境下将重编程因子导入细胞后,逐渐在重编程过程中转化为胚胎干细胞的培养条件。这个过程需要的时间要通过实验确定。例如,重编程小鼠的神经前体细胞需要经过从无血清培养条件到有血清的胚胎干细胞培养条件的转换,如果转换得太早,将无法获得iPSCs。在一些案例中,必须采用同时满足支持供体细胞和iPSCs生长条件的培养基。例如在重编程淋巴细胞的过程,联合使用了B细胞系生长因子和LIF,以分别满足造血细胞和iPSCs的生长要求。

人的iPSCs的分离也是一个特例,因为这些细胞对生长环境的要求比小鼠细胞更加敏感。例如,hiPSCs和hESCs展示出对强力霉素的敏感性,这是在人的细胞中采用诱导系统所必须考虑的。hiPSCs和hESCs同时展示出较低的单细胞存活率,因此在建立的hiPSCs和hESCs培养基中加入有利于单细胞存活的小分子化合物,比如Rho因子相关激酶抑制剂(ROCK抑制剂,Y27632)被认为有利于hiPSCs的分离,尽管他们的使用并非重编程所必需。

6. 重编程细胞的鉴定方法

在最初的重编程尝试中,科研人员预测多种因子的转导将会使细胞产生具有不同的命运,因此,采用选择性的仅让激活了胚胎干细胞相关基因的细胞才能存活的体系变得十分必要。然而由于需要引入等位报告基因,在基因组上造成了永久性的遗传修饰,使得这种系统不适合应用于临床实验组的重编程。几个改进方法应运而生,以建立有效并适合临床应用的用以鉴定和获取重编程细胞的方法。最初小鼠iPSCs是通过对胚胎干细胞特异而非必需的Fbx15基因进行选择而获得。尽管这些细胞可以在畸胎瘤形成上证明其多能性,但它们的基因表达谱和DNA甲基化状态与胚胎干细胞截然不同。后来发现对胚胎干细胞特异的必要基因(如Nanog、Oct4)进行选择获得的IPSCs更类似于胚胎干细胞。同时被了解的是推迟选择作用对产生完全重编程细胞很关键,这最终导致发现选择策略其实是不必要的,事实上甚至与原来的想法背道而驰。

仅仅基于形态标准鉴定iPSC克隆需要具有相当高水平的胚胎干细胞专家。大体上讲,小鼠的胚胎干细胞克隆可以通过折光率或“光泽”、形状、致密性及清晰的边缘加以鉴别,而人的胚胎干细胞则呈现出鹅卵石一样的外表,突出的核仁和明显的单个细胞间的边界线。重编程过程中形态上的改变已经在小鼠和人这两个系统中得到详细的描述(图9)。需要重点指出的是,形态类似但非iPSCs的克隆在人成纤维细胞重编程过程中也会出现。这些克隆经常被误认为(尤其是该领域的初学者)是iPSCs,但事实上它们与iPSCs是可以区分的。这些克隆往往比较松散(编者按,使用玻璃针可以轻易地割散克隆,是判断松散的标准),看起来成颗粒状,包含较明亮的细胞,而且通常出现在重编程的早期。

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其它鉴定iPSCs的方法也已有描述,这些方法在处理具有高背景的非iPSCs克隆(比如在人成纤维细胞重编程过程中出现的那样)或缺乏胚胎干细胞经验时显得很有用。其中的两种方法:胚胎干细胞特异的表面抗原和失去对外源基因的依赖性,已经被作为鉴定重编程细胞的策略。例如,在小鼠重编程过程中分离Thy-1-SSEA-1+的细胞群可以极大的富集可变为iPSCs,人胚胎干细胞特异的表面抗原Tra-1-81被用于辅助鉴定人成纤维细胞起源的真正的iPSCs克隆。克隆失去对外源基因的依赖性与完全重编程相关,这点可以通过采用在多能性状态下沉默的报告因子来进行评估,或者通过撤销外源因子,这点需要一个诱导瞬时转运系统。撤销外源作用后,依赖持续外源因子表达的细胞将被清除,从而选择性的扩增完全重编程的细胞。

7. 细胞的扩增和描述

这个涉及到从一个新的克隆到一个完整的iPSs细胞系建立的步骤与胚胎细胞分离后建系的步骤相同,这些步骤已经被其它实验室详尽的描述。然而,部分值得强调的是用于鼠和人的iPSCs传代及保证最终iPSC细胞系纯度的方法。鼠的iPSCs/ESCs可忍受解体为单细胞状态,新分离的克隆也可立即经过胰酶消化传代,这对其快速的扩增建系十分有利。然而人的iPSCs/ESCs则很难在单细胞状态下存活,而且最初的几代必须采用机械法传代,经过5~10代后才能适应胰酶的消化传代。由于人的iPSCs/ESCs十分倾向于分化,特别是最初的几代,因此不停的除去已分化的结构来防止它们被带入后续的扩增过程是十分重要的。尽管ROCK抑制剂的使用可极大地方便hiPSC/hESC的扩增,但其是否可防止分化还是未知数。由于结果可能导致分化细胞的残留,因此它的使用使实验人员有所顾忌。人和鼠的iPSC培养物都可能因不完全的重编程或分化的细胞而携带最初的污染,因此亚克隆对确保新分离的细胞系的质量显得十分必要。例如,在那些依旧维持外源基因表达的部分重编程克隆群中,亚克隆尤其重要。

用来判断完全重编程状态是否取得的几个标准已经被建立,其中包括一组与多能性相关的独特的特征,包括形态、分子、功能上的特征(图10)。形态学上讲,iPSCs必须看起来和ESCs细胞完全相同,证明可无限的自我更新。分子水平上看,iPSCs必须展示出与ESCs没有明显差异的基因表达谱,以及由此延伸出的与干细胞相关的特征,包括:(1)关键多能性因子的蛋白表达水平(比如Oct4、Nanog)和胚胎干细胞特异的表面抗原(比如小鼠的SSEA-1、人的SSEA-3/-4、Tra-1-60/-81);(2)功能性端粒酶的表达;(3)与逆转录病毒沉默相关的基因的表达,比如从头开始的甲基转移酶(特指Dnmt3)和Trim28。真正的iPSCs必须不依赖外源基因表达,因而没有转入因子的表达。iPSCs同时也必须在表观遗传学上与ESCs相似,包括证明其多能性基因的启动子去甲基化,雌性细胞的X染色体失活以及与发育相关基因上出现由具功能相反的重叠组蛋白修饰子组成的共价结构(一般指H3K4和H3K27这两个位点同时被甲基化,这样基因处于随时可能被激活的状态)。在功能水平上,iPSCs必须证明其有分化为所有三个胚层细胞的能力。一组相关标准已经被公布,按标准严格性顺序排列,分别包括:(1)体外分化;2)畸胎瘤形成;(3)嵌合体贡献;(4)生殖系转移;(5)四倍体互补(直接产生完全的ESC/iPSC来源的小鼠)。

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实施所有可能的分析是不切实际的,为了评估是否获得了真正的iPSCs,必须实施一组推荐的简化标准。这些简化标准包括:(1)所有形态特征,包括无限自我更新;(2)关键多能性基因的表达及与起源细胞相关的谱系特异基因随之下调的情况;(3)外源沉默;(4)可接受的最严格的功能分化证据。

在小鼠上,公认的标准是生殖系转移,即证明iPSC细胞对所有谱系细胞均有贡献,包括生殖细胞并最终形成子代的能力。尽管四倍体互补是最为严格的功能鉴定标准,但不像ESCs,iPSCs至今没有报道称可以通过该途径产生成体小鼠(目前已经报道可以通过四倍体互补技术产生健康小鼠并繁衍后代)。不清楚这是否反映了重编程领域的一个基本问题,比如不可能将一个体细胞进行完全的表观遗传学的改写;或者仅仅是一些技术问题有待解决,比如原病毒的整合,起始细胞类型的一致性;或者iPSCs的传代数。

因此,下一步的实验将需要真实的评价是否iPSCs能满足这一最严格的标准。

对人细胞多能性的功能鉴定而言,必须证明其可以形成畸胎瘤,并同时包括组织和免疫组化上的分析来确定这些结构来源于所有三个胚层。尽管畸胎瘤的形成是人细胞中最为严格的标准,但并不像在小鼠中的评价标准那样严格。比如,最初产生的小鼠iPSCs可以产生畸胎瘤,但不能形成活体嵌合鼠,这暗示其它的检验方法应该用于人iPSCs的分化功能测试。因此,通过移植模型来研究hiPSCs/hESCs的直接分化能力发展迅速,这个模型包括将hiPSCs和hESCs体外诱导分化为特定细胞,再移植到制定模型从而分析这些特定细胞的功能,甚至包括其安全性。

除证明多能性外,关键还要确保所产生的多能性细胞并不包含遗传上的紊乱。细胞经长期培养可能造成遗传上的不稳定,尤其是人的iPSCs总有形成不正常核型的趋势。因此,定期的检测iPS细胞系的遗传损伤对细胞系的正确维护十分重要。

8. 计算和报告重编程效率

精确的评估重编程效率对正确比较不同的独立实验十分关键,尤其在阐述优化的程序及重编程不同类型细胞时。多数的iPSC分离都报告了克隆形成效率,即形成的克隆数与种植细胞的比值。然而,报告值的巨大差异表明这种方法描述的是获取效率的一种不完备见解,因此需要将其它的变量因子纳入效率计算。运送因子的不同在不同的实验组中会导致巨大的差异。例如,病毒滴度的差异会导致运送因子数量上的不同,从而改变接受所有重编程因子的细胞群数量,进而导致最终克隆形成效率的改变。其它的影响因素包括细胞种植效率,细胞存活率(包括增殖和死亡率),以及对姐妹克隆(来源于统一细胞的多个iPSC克隆)的计算。

各个实验室用于定量克隆数的特殊方法经常不一样,这也是导致报告效率变化的一个重要原因。这些方法包括基于形态的计数、碱性磷酸酶活性、免疫染色、转基因和基因打靶等位报告基因的表达和克隆能形成iPS细胞系的能力,而且这些方法的差别在于对真正的iPSC克隆反映的精确度上。尽管形成iPS细胞系的能力是最为严格的量化方法,但这是一个十分耗费人力的工作,而且在克隆数较多的情况下是不切实际的。采用定点敲入等位报告基因或对内源性多能性基因的表达进行免疫染色是比较合适的替代方案,而基于表型鉴定或碱性磷酸酶活性的方法都不足以指示真正的多能性克隆。基于转基因的报告方法也需要慎用,因为这类基因的表达并没有受到像内源定点打靶等位报告基因同等的调控。这个观点已经通过细胞融合过程中Oct4报告基因激活的动力学所证实。在此过程中转基因的激活比内源定点敲入等位基因的激活要快的多。

许多步骤可被用来降低报告效率的变异性,从而最精确和真实的评价真正的重编程效率。这包括:(1)通过评估表达量和共转效率来控制重编程因子的运送量,并以表达所有因子的细胞的分数作为报告值,而不是种入的细胞总数的分数;(2)计算植入率,这个可通过计算细胞数或单细胞种植来完成;(3)通过单细胞种植消除对姐妹克隆的计数或回溯分析整合方式;(4)采用可信赖的严格的方法来鉴定和量化iPSC克隆。这种方法间的标准化将极大的方便独立实验间的解释和比较,最终将加速这个领域的发展。

9. 总结评价

iPSCs的产生代表着再生医学领域的一个重要进步,同时为细胞命运转换机制的研究提供了强有力的工具。尽管新的技术和观点不断公之于众,iPSCs分离的基础在于成功的使用了一组核心的转录因子。涉及到这个过程的关键步骤有:所采用重编程因子和分子的选择、运送系统、靶细胞类型的选择以及重编程因子表达参数、培养条件、细胞识别方法、多能性鉴定的分析方法。为了更好利用丰富的新信息,有必要对重编程过程中的某些参数进行标准化,比如重编程效率的计算和多能性状态的量化。出于同样的目的,这篇综述试图对目前分离iPSCs可用到的技术做一个全面的比较,并提出减少独立实验间变异性的标准,从而提供一个辅助设计,一个指导将来实验工作的框架,以及评价现存的iPSC文献。

文献来源:Nimet Maheraland Konrad Hochedlinger (2008), Guidelines and Techniques for the Generation of Induced Pluripotent Stem Cells, Cell Stem Cell, 3(6):595-605.

GIBH干细胞与癌症研究组/编译

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