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CRISPR :So easy ? ——一名记者的CRISPR初体验

Nov 07, 2016 No Comments

生物学家Roland Wagner(左)指导Jon Cohen进行构建CRISPR系统

生物学家Roland Wagner(左)指导Jon Cohen进行构建CRISPR系统。

 

 

是不是真的连傻瓜都能使用CRISPR这一基因编辑工具呢?

我对生物学相关知识有一定了解,但当我查阅新基因编辑技术CRISPR相关知识的时候,我却有些望而却步,该技术看起来非常复杂!但一位研究人员告诉我,CRISPR(全称clustered regularly interspaced short palindromic repeats)只是听起来吓人,用起来非常简单,傻瓜都能用。我自认为还是比傻瓜聪明得多,便打算验证一下这句话的真假。

于是,我就愉快地开始了我的CRISPR初体验。

相关资料显示,CRISPR在遏制或敲除基因上效果最佳,因此我打算试用CRISPR来敲除基因(如果想看视频,请参见bit.ly/vid-6312)。我设定了一个宏大的目标:用CRISPR敲除一个免疫基因,我猜想,敲除该基因,可以减少Zika病毒所造成的伤害。一旦成功,这将大大推动Zika病毒相关研究!(我的假设是,如果某个个体曾感染过登革热,并有该病毒的抗体,那么CD32可能有助于驱动Zika病毒的自我复制。) 

Roland Wagner是加州圣地亚哥Sanford Burnham Prebys医学发现研究所Sumit Chanda实验室的博士后,他同意担任我的CRISPR指导员。Wagner来自奥地利,是一个经验丰富的攀岩爱好者,喜欢有条不紊地完成工作。他查找分析了CD32基因的序列,CD32具有五个不同的蛋白质编码区。如果我们切割其中一个蛋白编码区的DNA,该基因最可能被敲除——它将不再表达CD32蛋白。

CRISPR使用向导RNA将分子剪刀——CRISPR的一部分,Cas9——导向到基因组中的精确位点。我们可以买到向导RNA(gRNA),但Wagner并不打算这么干。他指出,他不确定gRNA的价格是多少,但假设购买gRNA要花500美元,他们自己合成,就只要5美金。

gRNA序列能与我们想要切割的CD32基因上的一段长度为20个核苷酸的序列互补。但是,基因组中的其它地方也可能存在与这段短序列一样长的片段,并会导致分子剪刀切割错误的位点。这种“脱靶”效应会严重地影响实验结果,消除脱靶效应是研究CRISPR的关键目标。为了使CRISPR更具特异性,在靶向的20个核苷酸外,Cas9还需要一段额外的序列:N-G-G,其中“N”可以是任何核苷酸。当Cas9在20个目标核苷酸后发现N-G-G时,立刻结合并打开DNA双螺旋,随后gRNA与目标序列相结合。最后Cas9切割DNA的两条链。

为了自制gRNA,Wagner把我们鉴定的CD32序列粘贴到免费数据库Optimized CRISPR Design中,查找紧挨着N-G-G的、符合我们要求的20个核苷酸序列。CD32中有41个可选片段。数据库扫描整个人类基因组,检查是否其它地方也存在相同的序列——潜在的脱靶位点。我们选择了一个仅存在于CD32中的序列。然后Wagner打开另一个网站,订购该段DNA序列。

DNA序列到货了,我第一次尝试了使用移液枪。自从我30多年前毕业以来,我就没有在实验室工作过。那时,我学会了一种可能是由Louis Pasteur发明的移液技术:我把一根手指放在我的嘴里,然后把一种化学品吸到一个薄的玻璃管里,吸足了量后,就用指尖捂住玻璃管。 

现在,在Wager的实验室工作台上,我拿着一个看起来像喷枪的花式塑料小玩意,但是只要按一下,就能移取精确体积的微量液体。我的任务是将DNA序列从一个小试管移到另一个小试管中。第二个试管含有质粒——一种起到特洛伊木马作用的环形DNA片段。这个质粒是CRISPR实验定制的,里面已经包含了Cas9基因。它还含有60个核苷酸的“发夹”序列,这些序列最终将和那20个核苷酸链接在一起,形成完整的gRNA。

我用神奇的移液器把寡核苷酸转移到了质粒管里,添加缓冲液、水和酶。如果一切顺利,酶将切开质粒,切除一段DNA,并用gRNA替代这一段序列。但悲剧的是,实验进展不顺利。

当我移取酶的时候,Wagner指出,我的操作失误了!我在把吸头浸入液体之前,就按了吸取液体的按钮。

终于完成了一系列操作。在等待化学反应发生后,我们将CRISPR质粒带到电泳仪——一个有电线的托盘上。我们开始配胶,然后把CRISPR质粒滴加到不同泳道里。然后开始施加电压,这种凝胶电泳是根据分子质量将DNA分成不同的条带。用酶切出的小片DNA会形成明显的条带。

我的凝胶电泳只有一条带,来自质粒的条带。

“看来我们是失败了,” Wagner轻轻地说。“可能是你吸取酶的时候没吸到。”他说,刚开始做实验的时候,都会出各种差错。“这种时候,我会想回家。会有一种特别挫败的感觉。毕竟科学家的生活总是容易充满挫折的。”

我已经知道,不是任何傻瓜都能做CRISPR:至少,你得掌握基本的实验室技能。

Wagner与我同时进行实验,他的质粒正确地整合了gRNA和Cas9。然后,我们把质粒导入来自胚胎肾的细胞株中。几天后,我们从细胞中分离出DNA,用聚合酶链反应进行扩增,并使用电泳验证CD32基因已被切成片段。感谢上帝,我们终于成功敲除了CD32基因!!

“你做得很好,”Wagner安慰我说, “走吧!”

但说实话,我做得不好。但是CRISPR确实很好,很简单。


原文检索:
Jon Cohen. (2016) A reporter does CRISPR. Science, 354 (6312): 541.
张洁/编译

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