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在单细胞水平追踪细胞谱系

Jul 31, 2017 No Comments

在单细胞水平追踪细胞谱系

 

科学家们正计划通过单细胞分析,深入研究胚胎是如何发育成个体的。
      
20世纪80年代早期,英国分子生物学医学研究委员会分子生物学实验室(Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology)的发育生物学家John Sulston花了18个月观察线虫的发育。Sulston每天上两班,每班4小时,工作内容是使用光学显微镜观察一个秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)胚胎,并每隔5分钟画出他所看到的现象:受精卵变成了两个细胞,然后是四个、八个等,最后发育成线虫。Sulston每天待在一个小房间里专心地工作。最终,他利用显微镜解决了一个难题,并因此获得了1962年的诺贝尔生理学或医学奖。据这位诺奖获得者回忆,他当时工作非常投入,几乎从不分心。

他画的数百幅图谱揭示了线虫的早期发育过程,精确地揭示了671个细胞的出生,111个(或113个,取决于线虫的性别)细胞的死亡。每个细胞都可以追溯到其直接的母细胞,然后一直往上追溯。根据这些图和其它信息,Sulston和他的合作者能够起草首个,也是迄今为止唯一的多细胞生物体完整的细胞谱系图。

尽管在Sulston之前至少一个世纪前,科学家们就一直希望能够精细地记录生物体的发育情况,但难度非常大。没有人能够仅仅通过显微镜来追踪小鼠或人类的数十亿个细胞的命运。现在科学家们有了其它的解决方法,从单细胞水平上编辑基因组,并对其测序的技术的进步重新燃起人们对细胞谱系追踪研究的兴趣。

这项技术不仅吸引了发育生物学家,还吸引了遗传学家和技术开发人员。他们相信,了解细胞的发育进程——来自哪里,发生了什么——是生物学领域的下一个大热点。迄今为止取得的结果为人类发育提供了一些诱人的线索。例如,来自某个器官,例如大脑的细胞与其它器官的细胞的联系,比它们与周边组织的细胞的联系更加密切。而与线虫的简单发育过程相比,更复杂的生物体的发育过程存在更多的随机性,因此要绘制其完整的细胞谱系更为困难。

但即使不完整的细胞谱系图也能提供非常多的信息。Sulston的谱系图为程序性细胞死亡和小分子调控RNA的发现铺平了道路。新的细胞谱系图可以阐明干细胞在组织再生中的作用,并有助于研发癌症(一种细胞过度增殖引起的疾病)疗法。哈佛大学(Harvard University)的发育生物学家Alexander Schier预言一个新的时代即将来临。Schier正在使用基因组编辑技术来追踪斑马鱼和其它动物的细胞谱系进程。

 

重建发育进程

细胞的历史写在其基因组中:获得的所有突变都会被一一记录下来——传给子代细胞。2005年,以色列魏兹曼科学研究所(Weizmann Institute of Science)的计算机科学家Ehud Shapiro提出,研究人员可以使用人体细胞中的天然突变,来分析各细胞之间的谱系关系。他打算根据秀丽隐杆线虫的细胞谱系图来推导(至少从概念上推导)出人类细胞谱系图,并称这个项目为人类细胞谱系项目(Human Cell Lineage Project)。不过Shapiro明白,时机还未成熟,细胞谱系研究领域还没准备好。Shapiro指出,他们提出这个愿景的时候,单细胞基因组学领域本身,甚至连其名字都还没出现。

之后10年,研究人员成功开发了一套强大的工具来探测单细胞生物学,内容包括单个RNA分子、蛋白质、细胞个体和单个细胞的基因组。现在,Shapiro认为,时机已到,他们设想逐帧捕捉人类从受精卵到成人的整个发育过程。他指出,他们想完整地得到人类发育的3D电影。事实上,制作这样的电影,甚至不需要研究整个基因组。Shapiro的团队重点关注遍布整个基因组的重复DNA序列——微卫星(microsatellites)。这些序列发生突变的频率远高于基因组的其它位点。Shapiro的团队正在对几千名志愿者的DNA样本进行微卫星测序,以期确定细胞谱系。

波士顿儿童医院(Boston Childrens Hospital)兼哈佛医学院(Harvard Medical School)的神经科学和发育生物学家Christopher Walsh怀疑研究人员是否真的能够重建与线虫匹配的完整的人类细胞谱系图。但他表示,即使是绘制部分细胞谱系,也能对相关科研工作带来非常大的帮助。Walsh还指出,他研究皮质细胞谱系已有25年了。以往,如果直接在人脑中研究皮质细胞,简直就是痴人说梦。但现在居然实现了。

Walsh团队在2015年开展的研究中,对来自3名死后捐献大脑以协助研究的志愿者的36个皮层神经元进行了全基因组测序。进行细胞谱系重建后,他们发现关系密切的细胞散布在皮层各处,同时局部区域的细胞具有多种谱系。后代细胞似乎会离开生成部位,转移到相对较远的区域。例如,在同一个个体中,某个皮层神经元与心脏细胞之间的谱系关系,要比这个神经元与其周围四分之三的神经元的谱系关联更密切。Walsh表示,这是他们完全没有预料到的。

Walsh的团队正在试图了解大脑中的嵌合现象(一些细胞含有不同基因突变)对健康的影响。例如,他们已经确定,即使一小块脑区域中只有少数细胞携带致病突变,也可能会引起癫痫。此外,他们发现来自健康个体的单个神经元也携带了一些致病突变,如果这类神经元分布更广泛,就会引起癫痫发作或精神分裂症。从这项工作看来,重要的是哪个细胞会携带突变。Walsh指出,总体来说,也就是谱系决定了致病与否,以及导致什么疾病。

其他科学家也基于成人细胞基因组,取得了重要发现。在今年发表的研究中,英国维康信托桑格研究所(Wellcome Trust Sanger Institute)的遗传学家Michael Stratton等人对来自241名乳腺癌妇女的白血球进行了测序,并查找仅可在一部分血细胞中被发现的突变。该研究发现,有些突变发生得非常早,可能发生在胚胎只有两个细胞的时候。他们指出,这些细胞对成年人血液系统的作用是不一样的。这可能是因为某个细胞比另一个细胞繁殖得更好;或者像Stratton怀疑的那样,很偶然地,某个细胞可能对发育中的胚胎的影响比对胎盘或其它支撑组织的影响更大。

Stratton指出,未来的研究将试图找出发育过程中限制某些细胞发挥作用的瓶颈所在。目前他们正打算在正常人体中观察发育机制。

 

从一团细胞到细胞条形码

华盛顿大学(University of Washington)的遗传学家Jay Shendure仍记得他迷上细胞谱系的那一天。14岁那年,他对生物学和计算机都很感兴趣,并写了一个程序来模拟大量的增殖细胞。这个程序打动了他的叔叔——一位从印度来访的修复外科医生。叔叔认为Shendure真是太不可思议了!叔叔指出,某一天Shendure将会做同样的事情,不过到时编程模拟的将不再是一团细胞,而是整个婴儿。

近十年后,Shendure成为了哈佛大学(Harvard University)的遗传学家George Church实验室的一名一年级研究生。Church提出了一系列想法(Shendure指出,所有想法在当时看来都非常疯狂),其中之一是在一个实验中同时重建多个细胞谱系。Shendure用了6个月来尝试使用被称为重组酶的DNA翻转酶来构建细菌分裂的标签。事实上,他们创造突变,而不是利用基因组中的天然突变来追踪细胞谱系。

最终,Shendure换了项目,但是几年前,当研究生Aaron McKenna和Greg Findlay加入他们实验室时,他重拾了这个想法。他们意识到,近年大火的基因组编辑工具CRISPR-Cas9可能可以帮助他们把可追溯突变引入基因组的任何部位。他们与Schier实验室合作,在两个单细胞斑马鱼胚胎中使用了CRISPR-Cas9技术,并用它来修饰已植入到基因组中的“条形码”(图:细胞谱系追踪)。然后,他们对成年斑马鱼细胞中的这些条形码进行测序,并根据细胞携带的突变,分析其谱系。

 

 

细胞谱系追踪

 

他们构建的谱系图显示,少量形成于早期的胚胎细胞在某个特定的器官中产生了大部分细胞。例如,一条鱼中超过98%的血细胞来自该团队跟踪的1000多个细胞中的仅仅5个细胞。虽然这5个细胞也能分化成其它组织细胞,但是数量非常少。譬如,心脏中的肌肉细胞(主要由少量的前体细胞发育得到)中几乎没有由这5个细胞分化而来的细胞。对此,Shendure非常惊讶。他的同事Schier则表示,Shendure仍然在努力解读这些数据。

柏林Max Delbrück分子医学中心(Max Delbrück Center for Molecular Medicine)的发育生物学家Jan Philipp Junker指出,早期胚胎的细胞谱系图个体间差异非常大,所以Shendure和Schier团队观察到的特定细胞在谱系树中扮演主导地位的现象可能只是偶发事件。Delbrück表示,早期胚胎的细胞可以从一个部位转移到另一个部位,并且其中只有一部分细胞与机体最终形成有关。因此,跟踪后期的发育事件,如形成不同组织的三个胚层可能更有意义,因为这些事件相对不受运气影响。

Junker等人在CRISPR的基础上开发了一系列方法来追踪细胞的发育进程。他和荷兰乌得勒支大学(Utrecht University)的系统生物学家Alexander van Oudenaarden采用这种方法来跟踪斑马鱼损伤鳍片的再生行为。他们发现,再生行为与发育的方式非常类似:当干细胞再生鳍片时,鳍片中再也找不到原来发育成原始鳍片的几个细胞了。该发现证实了以前的研究,但基于CRISPR的方法允许他们在单个实验中追踪数千个细胞的谱系。

Church表示,他的团队已经使用CRISPR来研究小鼠的发育进程,并且已经设法记录了形成三胚层的胚胎细胞的分裂过程。他认为他们很快就能完整地记录小鼠的谱系了。

一些研究人员不仅想知道生物体的细胞是如何相互联系在一起的,还想了解发育过程中这些细胞身上发生了什么事情。加利福尼亚理工学院(California Institute of Technology)的Michael Elowitz和Long Cai开发了一个谱系示踪剂,以产生荧光探针,帮助研究者观察细胞的发育进程。他们的方法可以跟踪某些发育基因是否已经在特定的谱系中被激活。7月5日,Elowitz、Shendure和Schier一起获得了Paul G. Allen Frontiers集团为期4年、总金额为1000万美元的资助。他们三人计划开发可以记录细胞谱系进程和分子事件的记录装置——合成染色体。

剑桥麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)合成生物学家Tim Liu指出,这种记录装置可以让科学家们更精细地观察细胞发育。目前Liu也在开发记录细胞发育的技术。他表示,也许在不久的将来,人们会看到某些细胞疗法配备了这样的记录装置,但短期内还不大可能实现。Liu还强调,他是绝对不会把CRISPR记录装置注射到病人身上的。

 

生命谱系

最先应用新型谱系追踪方法的领域是癌症。Walsh表示,癌症是一种谱系病,它由干细胞引起。目前研究人员正着手解决的是转移性肿瘤细胞的起源问题。这些转移性肿瘤细胞从原发性肿瘤中出现后,可侵入其它器官,有时是远端器官。它们往往是最难杀死的肿瘤细胞,也是最有可能杀死病人的肿瘤细胞。

德克萨斯大学安德森癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center)的癌症遗传学家Nick Navin领导的一个团队在5月10号发表了两种结肠癌的谱系图谱。结果表明,肝癌侵袭性转移细胞携带了很多原发肿瘤的DNA突变,这表明转移行为发生在癌症晚期,并且不需要出现新的突变来就可以发生转移。谱系测绘还可以显示肿瘤是否如遗传学家所论证的那样,由单细胞发育而成;或者像一些成像研究显示的,肿瘤源于多种细胞。Navin认为类似的工作可以用来指导治疗。包括他的团队在内的多个团队目前正在追踪患者开始服用药物后的癌细胞谱系。他们希望这些研究可以发现耐药谱系,使医生能够及时地选择更好的治疗方法和适当地切换药物,提高疗效。

不过,这个技术离进入临床还有很大一段距离。加州斯坦福大学(Stanford University)的生物工程师Stephen Quake设计了基于CRISPR的跟踪细胞谱系的方法,并决定在线虫中开展测试工作。Quake指出,有一个检验的金标准(Sulston的线虫细胞谱系图)真好。他和他的团队之前使用CRISPR技术在发育过程中让线虫基因组发生突变,随后对成虫的细胞进行测序。这项研究所花的时间比Sulston用显微镜花的一年半要少得多。但是,Quake表示,他们开发的谱系图也不完整。是的,该项研究捕获了线虫发育中的关键转变——细胞开始分类,某些可以形成肠道,某些则生成身体其它部分,但这幅图谱缺乏Sulston用眼睛观察到的精致细节。Quake直率地表示他对获得的结果不太满意,并且直到看到使用类似技术的其它论文的仓促发表,他才开始考虑论文发表的事宜。Quake一直觉得这类技术还有明显的欠缺。

业界一直有一个争论,即Sulston的线虫细胞谱系图是否把该领域的标准设置得太高了。Junker指出,现在谱系图的整个概念都受到了Sulston谱系图的影响。这一点可能值得大家反思。

在鱼、小鼠和人类中,没有两个个体的细胞谱系看起来是完全相同的,并且每个个体的谱系都可能在整个生命周期中发生改变(组织修复和再生)。Junker等人希望新技术能帮助生物学家解答细胞谱系差异的问题,即个体之间、器官之间和随着年龄的变化,细胞谱系可能会发生何种变化。正如Schier所说,他们现在还不知道构建心脏的方式到底有多少种。

Elowitz指出,正是由于细胞谱系进程的研究领域存在太多未知,单细胞谱系技术才显得如此具有革命性。Sulston的细胞谱系图让生物学家进入了完全未知的新领域,而单细胞谱系技术也同样如此。我们不能确定会有什么发现,但可以肯定的是,我们将找到新大陆。

 


原文检索:
Ewen Callaway. (2017) The trickiest family tree in biology. Nature, 547(1038): 20-22. 
张洁/编译

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