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shRNA表达克隆

认真检查你的化学分子库

Sep 26, 2017 No Comments

认真检查你的化学分子库

这是Novartis制药公司位于瑞士巴塞尔的化学分子库,里面储存了将近300万种不同的化学分子。

 

化学探针(Chemical probes)和化学分子库很容易弄混,这往往就让那些不那么小心的生物学家们得出了错误的结论。

德国法兰克福Goethe大学(Goethe University Frankfurt in Germany)的药物学家Stefan Knapp得到的研究结论让他感觉自己就像在坐过山车。他的同事们刚刚发现了一个对肿瘤生长非常重要的蛋白质。此外,他们还发现了该蛋白质的抑制剂分子。于是他们用该抑制分子开展了后续的抑制实验,可是却没能重复出之前的结果。但是随后他们改用从另外一家供应商处购买的相同抑制剂来做实验,却又得到了更加好的实验结果。

这种现象原来是因为这种抑制剂分子存在不同的旋光异构体(enantiomers),所以才得到了不同的实验结果。Knapp发现,只有左旋异构体(有意思的是,右旋异构体就是抗肺癌药物crizotinib)才具备抑制活性,但是供应商提供的抑制剂分子是不同旋光异构体分子的混合物,而且在每一批次的产品里,不同旋光异构体的比例还不一样。

这个项目的负责人——维也纳分子医学研究中心(Research Center for Molecular Medicine in Vienna)的系统生物学家Guilio Superti-Furga认为,他们碰到的这个事件只不过是生物实验工作中的一个缩影,有太多的生物实验都是因为化学试剂的问题而失败的。很多时候,科学家们根本不知道他们手里的试剂究竟是什么,以及是否与标签宣称的一致。很多时候,实验的结果也与预期的相差很远,甚至完全不能达到预料中的特异程度。Superti-Furga 表示,这两个因素极大地阻碍了化学品对生物学的影响和意义。

美国加州Scripps研究所(Scripps Research Institute)的免疫学家及化学家Kim Janda则更加直接,他指出,如果你对实验时使用的化学试剂的问题不够谨慎,那么你就会惹上大麻烦。

 

教训

从事细胞生物学研究的科研人员们都离不开各种化学试剂,比如在研究蛋白质功能时用到的各种最常见的化学探针,或者各种实验工具试剂。小分子抑制剂也是最常见的化学试剂,它们可以帮助科研人员更加方便地(而无需使用繁琐的遗传学技术)了解被抑制底物的生物学功能。当然,很多机构里还建立了规模庞大的化学分子库,可以从中筛选出各种有用的化学试剂和药物。

样品不纯、或者存在其它预料之外的活性,不论是哪种情况,都会让没那么谨慎的科研人员花费了大力气做实验之后,竹篮打水一场空。其实大家早就知道,化学实验存在非真实结果的问题,但是大家都认为这属于偶然事件,并不是普遍存在的。幸好我们现在有很多网上的资源可以使用。比如由专家们打理的化学探针门户网(Chemical Probes Portal,www.chemicalprobes.org),就对100多个常用的化学试剂进行了评测。探针捕手(Probe Miner,http://probeminer.icr.ac.uk/)和探针及药品门户网(Probes and Drugs Portal,www.probes-drugs.org)都汇集了各种公共资源,以帮助科研人员们选择最好、最合适的化学试剂。

实际上,对这些商品化的化学试剂做质量评测是一件非常困难的工作。这些试剂里往往都含有合成时出现的副产品,或者试剂降解之后产生的杂质。化学家Josh Bittker在美国博大研究院(Broad Institute in Cambridge, Massachusetts)主持一项高通量筛选工作,他们专门构建了一个化学药品库,其中收集了各种在临床试验中使用过的药物。也正因如此,他们得以发现,在这些药物中,这种“污染物”其实是非常常见、普遍存在的。

让Bittker感到吃惊的是,在一共8584种化学分子里,接近29%的分子都过不了质控检测关。有些分子里的杂质都达到,甚至超过了15%。目前通常会出现的情况是,同一家供应商提供的不同厂家生产的同一种试剂,有些就符合质控标准,有些就无法通过检测。这种情况在干粉型的试剂(而非溶液型的试剂)中更为常见,因为干粉更加容易降解。

然而,实际情况可能更加严重。Bittker等人主要通过分子量来进行检测,因为我们是无法检出异构体(isomers)分子的。

 

化学试剂的问题

医学化学家可能会指出,化学药品可能存在的结构的数量要比宇宙中的星星还要多。供货商出售的就超过了1000万种。科研人员需要使用某种化学品时,只需要找到合适的供货商就可以了。而且,如果有篇非常著名的论文报道了一种分子的生物学活性,而且该药物已经进行了临床实验,那么它就会变成“大路货”,基本上每个供货商都会提供这种化学试剂。制药公司有时也会自己设置授权代理商,提供试剂级别的药品,虽然这些药品的价格比普通的更贵,但是得到的实验结果也更加可靠。

 在一个非常知名的案例中,将近20家供货商都出售博舒替尼(Bosutinib)这种抗癌药。但后来人们发现,他们出售的其实是一种与博舒替尼在结构上非常类似的分子,这种分子的化学基团是错配了的。这两种“博舒替尼”都可以与信号因子蛋白结合,但是结合能力却大相径庭,结果,数十篇论文都因为这些杂质而被质疑。

 

发现微小差别

 

德国多特蒙德的合约研究组织Taros 的CEO Dimitrios Tzalis建议大家选择可靠的供货商购买化学试剂,不要为了省钱,从那些未经检验的机构购买试剂,为了节省这么一点实验经费,结果可能会付出更大的代价。

Bittker 也认为,在购买试剂时,你一定要清楚你要什么,你在做什么。如果这笔交易太划算了,那么就得小心了。还有一点需要注意的是,应该要求供货商提供质量控制数据,如果他们拿不出来,也需要谨慎对待。很多从第三方机构购买的试剂也存在质量不稳定的问题。如果没有人验证过这批试剂,那么也很有可能出问题。

很多文献也会给我们造成困惑。比如英国牛津大学的化学生物学家Kilian Huber 就曾经阅读过一篇论文,其中就提到SCR7这种酶抑制剂可以极大地提高CRISPR–Cas9 基因编辑实验的效率,于是他也决定试一试。可是他的研究生却没有合成出论文中报道的这种化学分子,Huber不得不放弃这个实验。后来生产SCR7这种酶抑制剂的公司,英国布里斯托的Tocris 公司宣称,他们的很多代理商销售的其实并不是同一种SCR7,而是在结构上与SCR7非常接近的一种物质(go.nature.com/2vapstf),而论文中用到的那种SCR7其实是没有活性的。这也是我们在开展化学实验时非常常见的一种情况。还有一部分科研人员对这“一大类”SCR7是否真的具有酶抑制活性提出了质疑。第一个发现SCR7酶抑制活性的研究者告诉我们,他们在2012年发表的那篇论文是真实可信的,但是他们在实验中用到的那种具有抑制剂活性的SCR7结构非常不稳定。而且他们还提到,SCR7会变成环形结构,但是他们那篇论文,或者Tocris 公司都没有提的这种情况。

Janda也碰到过类似的情况,他在文献中读到,有一种分子可以极大地提升抑癌蛋白(tumour-suppressor protein)的表达量,于是他打算做一些后续的相关研究,但同样碰到了试验样品不纯的问题。他们在试验中并没有发现该分子具有在论文里提到的促进抑癌蛋白表达的能力。最开始,Janda还认为是他的博士后的有机合成试验技术(organicsynthesis skill)有问题。后来他得知,其他一些实验室并没有自己完成合成工作,而是从包括美国国家癌症研究院(US National Cancer Institute)在内的供货商处购买这些试验试剂的。这些供货商在最开始发表的文章中就有问题,而且他们提供的也是错误的试剂。实际上,一家正在准备用那种分子开展临床试验的公司已经为该分子申请了专利,但是该专利申请书里标明的也是错误的结构。后来,该专利被再次公布,但也是在Janda为正确结构的分子申请专利之后的事了。

Janda认为,我们几乎不可能知道这种样品不纯的问题究竟有多普遍,但是在试剂科研工作当中,肯定有很多这类事件存在,只不过没有被发现,或者没有人报告而已。

就职于美国明尼苏达大学(University of Minnesota in Minneapolis)的医学化学家Nick Levinson指出,科研人员们是否持有怀疑态度这非常重要。Levinson在做博士后期间,曾经花了好几个月去研究博舒替尼如何与靶蛋白结合,可后来他却发现,他做的根本就不是博舒替尼的试验,因为试剂就不是博舒替尼,也有很多科研人员都有过和他一样的遭遇。据Levinson介绍,他们实验室最大的不同就在于,他们对试验结果都持怀疑态度。如果他们取得了任何出乎预料之外的试验结果,或者看起来不太对的试验结果,他们首先想到的就是,肯定是哪个试剂出了问题。可是要发现真正的问题,却并不容易。就拿这个博舒替尼来说,我们通常需要一种特殊的核磁共振光谱技术(nuclear magnetic resonance spectroscopy)才能进行检测,而且还需要得到博舒替尼与靶蛋白结合复合体的结晶。但是几乎所有的科研人员都不会进行这样的验证工作。

 

不纯的产品

英国伦敦癌症研究所(Institute of Cancer Research in London)的所长Paul Workman建议科研人员们在使用新的化学探针时,至少需要用两种不同的方法去验证,或者寻求专业人员的建议。他同时指出,他们正在提醒生物学家们,要多掌握一些化学知识。一个好的生物学家绝对不会在不做任何对照预试验验证的情况下就直接用抗体做试验,也不会随便找人拿一个克隆,不进行测序验证就开始后续的试验。在使用化学试剂时也应该同样谨慎。比如先用质谱、核磁共振、或者其它方法对化学试剂进行验证。

即便购买的化学试剂里含有有效成分,也可能会得到错误的试验结果。美国新泽西州罗氏公司(Roche in Nutley, New Jersey)的科研人员Johannes Hermann负责一个新药开发的工作,他们发现一批化学分子能够抑制某一种酶的活性,而且这些化学分子的浓度越高,它们的酶抑制活性也就越强,这看起来好像是一个非常不错的研究结果。

可是后面的结果就没那么合乎常理了,这些分子在结构上的一点点变动都会对其活性造成很大的影响,但是如果结构变化很大,却又不会影响其活性。最后Hermann等人意识到,这些活性分子都有一个共同的特点,那就是有锌的存在。当科研人员们在反应中添加了锌,就会得到非常肯定的结果。然后,他们又添加了螯合剂(chelator),结果就不能得到酶抑制的试验结果,因为这些螯合剂与锌结合,消耗了这些金属元素。据现在在美国Johnson & Johnson公司担任数据科学家的Hermann介绍,那真是一次痛苦的经历。他建议大家在得到试验结果之后就马上用螯合剂验证一下,不要像他们一样浪费那么多时间和精力。

Hermann的经历在制药企业当中其实非常罕见,也只有在制药企业里他才有时间把这个经历给写下来。不过也有其他制药企业的化学家有过类似的经历,但他们碰到的情况可能是需要添加铜(copper)、或者钯(palladium)等其它元素。肼(hydrazine)等用于合成反应的小分子无机化合物也会让试验失败,因为它们可以抑制靶标酶蛋白,或者影响活性评测反应。

最常见的情况是在试剂瓶被打开之后,试剂才出现问题。据德国Merck KgaA公司生命科学试剂部门的负责人Heather Holement介绍,重复冻融是最容易使试剂降解的一大原因,而且有很多分子在冷冻条件下是非常不稳定的。在做细胞实验,或者蛋白试验时,将溶于有机溶剂的化学试剂加入水溶剂反应环境之后,也有可能会析出。科研人员们还需要考虑库存试剂的质量差异问题。Holement建议,最好每次在做试验之前,先用溶剂做一下对照试验。也可以先不加细胞或者蛋白样品,做一下空白对照试验,这可以排除很多假阳性结果。

很多时候,我们得到的阳性结果其实是试验体系里的其它分子,比如载体(vehicle)等,而非目标分子导致的。澳大利亚墨尔本Monash大学(Monash University in Melbourne, Australia)的血液学家Jake Shortt就曾经用常规的方法,将抗癌药物溶于NMP(N-methyl-2-pyrrolidone)这种常用的有机溶剂里,然后再注入小鼠体内,开展科学实验。结果他惊奇地发现,在没有用抗癌药的对照组里也出现了明显的“抗癌”效应。这说明NMP就具备抗癌活性。现在,Shortt已经开始对NMP的抗癌活性进行临床试验了。不过还是有很多科研人员在使用NMP作为有机溶剂,来溶解一些药品。

对于像Bittker开展的这种药物筛选试验来说,得到初筛结果之后,工作才真正开始。在化学分子库里,那些分子可能已经保存了好几个月,甚至好几年了,因此它们的质量其实非常差,存在大量的降解和混杂等问题。所以在得到初筛的结果之后,第一个工作就是进行重复验证。然后,再选择另外渠道来源的同一种分子进行再次验证。Bittker认为,如果试验结果不理想,那么就应该放弃了。他还指出,这就是个兔子洞,如果是污染导致的阳性结果,你就别浪费时间深究下去了。

还有一些科研人员筛查的对象是天然化合物,Bittker的忠告对于他们同样适用。据美国伊利诺斯大学(University of Illinois at Chicago)的天然物质专家Guido Pauli介绍,从植物中提取的化合物基本上也都是混合物,很少有纯品的情况。而且很多时候你会发现,纯度越高,则活性越低,这也就意味着,我们认为的有效成分其实根本就不是有效成分,其它的“杂质”才是有效成分。

哪怕是已经被鉴定得非常清楚的天然化合物,混合也是一个大问题。比如,庆大霉素(gentamicin)这种抗生素是从在发酵罐里生长的一种细菌里分离、提取出来的。这种细菌会合成出好几种非常类似的物质,但是这些物质的活性和毒性却截然不同。据美国斯坦福大学(Stanford University)的医药化学顾问Robert Greenhouse介绍,商业化的庆大霉素的粗成品里就含有多种杂质,水含量也不相同。这样一来,那些比较“粗心”的科研人员就会以为他们使用的就是庆大霉素,其实他们根本不知道这里面都含有哪些物质,哪些物质可能会对他们的试验结果造成影响。

即便试剂分子已经被鉴定无误了,它也在试验中发挥了作用,但还是有可能没有以我们预计中的方式与其底物结合,来发挥作用。比如,聚合物(aggregator)能够以一种肥皂式的方式覆盖其它分子。如果在试验中添加去垢剂,就可以去除这些假象。

Workman指出,很多时候,你可能用到了真的试剂,但它们其实也就是很糟糕的试剂。
Workman认为,资源和教育都很重要,但是最重要的还是科研人员本人。选对合适的试剂是每一位科研工作者的责任。“买家责任自负”,这句话一定要时时刻刻牢记在心。

 

 

补充阅读:做化学试验的六个小窍门
美国癌症研究所(US National Cancer Institute)化学品合成及药物储存部门的主任Joel Morris认为,如何鉴定化学品、如何判断其纯度,这都与所需要开展的试验有关。对于储存在化学品库里的分子,在没有得到初步的试验结果之前,不值得花费大力气去做鉴定工作。但是如果已经在细胞实验,或者动物实验中表现出明显价值的“单一”分子,就需要仔细的加以鉴定了。接下来,Morris为大家总结了六点小窍门。
*根据每一个化合物的CAS号(每一个CAS号都与化合物的结构一一对应)来排序,而不要以化合物的名字来排序。
*任何从外部机构获得的化合物,都要求对方提供一份详细的质控文件,其中需要包括诸如高效液相色谱分析结果、质谱分析结果和核磁共振分析结果等数据。
*任何从外部机构获得的化合物,都要求对方提供化合物制备的相关信息。这有助于判断其中可能会混有哪些杂质。
*任何从外部机构获得的化合物,都要进行单独的验证。
*如果化合物存在多种不同的结构,那么就应该通过光学纯度(optical purity)或者手性层析(chiral chromatography)来判断其具体结构。
*为了确保化合物的纯度及结构,最好自己合成化合物。

 

 


原文检索:
Monya Baker. (2017) CHECK YOUR CHEMISTRY. Nature, 548: 485-488.
Eason编译

 

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