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shRNA表达克隆

血液研究推动膜科学发展

Dec 12, 2017 No Comments

血液研究推动膜科学

 

新技术降低了膜科学领域的门槛,让更多学科的科学家能进军这一领域。

当加州大学圣地亚哥分校(University of California, San Diego)的纳米工程教授张良方(Liangfang Zhang)想到血时,第一反应并不是恐怖电影或犯罪,他甚至没有想到血液的生理意义——为身体各部分提供氧气和葡萄糖,同时带走废物。在张良方的眼中,血液是人体细胞膜最有效的来源。他表示,红细胞是人体最丰富的细胞。一立方厘米的血液中含有大约五十亿个红细胞,这意味着血液能提供充足的细胞膜。

八月下旬,张良方在香港停留期间向我们解释了他为什么需要红血球。当时他正前往参加第七届中国国际纳米科学技术会议(ChinaNANO 2017)——一个在北京举行的大型纳米科学会议——的途中,他计划向观众介绍一种通过红细胞膜裂解,使细胞膜碎片形成小球——囊泡,并让每个囊泡中包裹一个感兴趣的纳米颗粒的技术。由于细胞膜包裹着纳米粒子,所以这些粒子不会受到人体免疫系统的攻击。

得益于一系列新方法的开发和完善,在过去5年里细胞和亚细胞膜的研究日渐热门。这些技术以前所未有的细节揭示了细胞膜的组成成分和工作机理,以及在许多情况下,它们如何在细胞的不同部分之间移动的机制。

这些进步为其它领域的研究人员敞开了膜科学领域的大门。细胞膜的研究不再局限于细胞生物学家和生物化学家之间。张良方开始了自己作为化学工程师的职业生涯,用他的话来说,在过去,化学工程师主要面向石油业务。但是凭着自己在化学净化、质量和热量转移上的丰富经验,以及工程师解构和设计的本能,张良方已经成功转型为细胞膜研究者。现在,他的团队囊括从免疫学家到材料学家等各个方向的人才。随着膜研究领域的专业范围的扩大,尖端实验室的地理范围也在扩大,其中中国的膜研究已达到世界顶尖水平。

随后,张良方把话题转向了毒素。他指出,目前已知的攻击红细胞的毒素家族大约有80个,而且每类毒素以不同的方式攻击红细胞。一些毒素通过与红细胞表面的蛋白质受体结合,从而牢牢固定在红细胞上,对其进行攻击。其它毒素与构成膜的磷脂相互作用的过程会撕裂细胞膜。这种攻击方式的差异让开发一种能够应对各种红细胞毒素的万能药变得极为困难。基本上,创造一种可以同时瞄准80多个毒素家族的合成材料是一个不可能完成的任务,因为很多毒素的作用机制完全不同。

目前张的实验室已经开发了一种被他们称为纳米海绵的材料,该材料可以清除从动物毒液到耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)等感染因子产生的液体等多种溶血毒素(使红细胞裂解的毒素)。纳米海绵的核心是具有生物相容性的聚合物纳米粒子,外面由红细胞膜包裹。每个海绵的表面积比红血球小3000倍以上,但可以吸收数十到数百个溶血毒素分子。纳米海绵尺寸很小,在血液中的数量可以大大超过红细胞的数量。因此它们有更大的概率与毒素发生作用并结合,从而保护红细胞。Zhang表示,开发红细胞毒素的万能药的唯一途径是利用天然红细胞膜。因为所有毒素都会靶向细胞膜。

细胞终其一生中可能遇到成千上万种化学物质,毒素分子只是其中之一。细胞膜维持细胞结构,起到屏障作用。如果外部信号想操纵细胞行为——例如阻止细胞繁殖或改变细胞的新陈代谢——它必须首先通过细胞膜传递信息。天然分子和合成分子都是如此;目前大约60%的处方药靶向细胞膜蛋白。 

 

方法论拓展

在20世纪80年代早期,Johann Deisenhofer、Robert Huber和Hartmut Michel确定了一种细菌的光合反应中心的结构,并于1988年共同获得了诺贝尔化学奖。通过X射线晶体衍射法,他们建立了相关蛋白质的结构图(J. Deisenhofer et al. J. Mol. Biol. 180, 385–398; 1984)。

结晶是蛋白质鉴定的关键步骤,但并不适合膜蛋白。当细胞膜受到挤压时,构成细胞膜的脂质会产生侧向压力,从而使嵌入到膜中的蛋白质保持特定构象。同时,从脂质分子平面上剥离蛋白质——X射线科学家通常需要以这种方式来得到蛋白晶体样本——有很大概率会改变蛋白的形状,从而无法解读蛋白质的功能和工作原理。

幸运的是,低温电子显微镜(cryo-EM)应运而生。这项技术通过冻结样本,从而最大限度地保持样本原来性状,然后使用电子束照射样本,基于电子反射的图样反推分子结构。澳大利亚悉尼大学(University of Sydney)的化学家Ronald Clarke表示,冷冻电镜已经成为确定膜蛋白结构的一种主流方法,被经常用于研究离子泵——可以跨膜转运离子的蛋白质。

冷冻电镜技术不断改进,冷冻固定对样本结构的影响远小于结晶衍射对蛋白结构的影响。 Clarke指出,现在,我们可以很好地解析膜蛋白结构。这意味着许多理论家已经进入这个领域,因为现在我们可以对分子动力学进行模拟。基于蛋白结构,我们可以模拟膜蛋白的功能。换句话说,计算机科学已慢慢渗透到膜科学中。

鉴定膜蛋白的精微结构意义重大。目前,蛋白质数据库(Protein Data Bank)——一个存储三维结构已知的生物分子信息的在线数据库中,膜蛋白数据与非膜蛋白数据的比例不到1/300,而生物体中膜蛋白占所有蛋白种类的1/4。

生物物理学家徐涛(Tao Xu)开发了一种新技术,该技术在膜科学领域大有可为。2004年,就职于中国科学院生物物理研究所(Chinese Academy of Science’s Institute of Biophysics)的徐涛提出了一种追踪人体对胰岛素反应的方法。他用一种被称为全内角反射荧光显微镜(internal reflection fluorescence microscopy, TIRF)的方法来观察含有GLUT4蛋白质的囊泡。这些囊泡从细胞内外流,并与肌肉或脂肪细胞的细胞膜融合。一旦细胞膜上结合的GLUT4蛋白达到饱和,更多的葡萄糖就会进入细胞来帮助调节血糖水平。

许多2型糖尿病患者体内都存在GLUT4转移减少的现象,因此用于追踪该过程的方法可以准确地找出哪一步发生了问题。徐涛表示,在他们开发出囊泡可视化方法之后,很多人都想和他们合作。

 

中国研究占鳌头

徐涛的实验室大约有20个人,其中许多人都在研究另一种在胰岛β细胞内运输蛋白的囊泡。这种囊泡在糖尿病中也有重要作用。他指出,中国有很多膜科学研究者,其中许多人在美国和欧洲接受过培训。他感觉中国的膜科学发展非常迅速。徐涛认为现在是开展大项目的好时机。

徐涛指的是中国国家自然科学基金会(National Natural Science Foundation of China)发起的计划。该组织已经发起了研究细胞器相互作用网络及其功能的重大研究计划,于2018年1月开始,持续两到三年。该组织已拨出约3000万元人民币(450万美元)的科研资金。近期的讨论表明,政府的资金支持可能会持续四年,并可能进一步延长。

中国武汉大学(Wuhan University)的生物化学家宋宝亮(Song Baoliang)是申请人之一,他的研究方向是探索胆固醇在细胞膜中的作用。他认为,这项重大计划有助于中国膜生物学和细胞生物学的发展。这些资金中的一部分将用于研究膜接触位点(membrane contact sites)——一个最近火起来的课题。这些位点是细胞器膜的延伸,彼此不融合,但距离足够接近,可以以某种方式化学相互作用。科学家们希望弄清楚这种交互的机制。

宋宝亮在德克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)做过几年博士后,当时他师从1985年的诺贝尔生理学或医学奖获得者Michael Brown和Joseph Goldstein。在回国后的十几年里,他见证了中国膜科学的发展。虽然膜科学相关就业市场变化缓慢,但随着相关基金的增多,基金申请的竞争日益激烈。宋宝亮指出,这主要是因为膜科学研究人员的数量不断增加,而且水平也不断提高,他带的研究生中,很多仍然在申请美国的博士后,但近年来,有些会选择留在中国。甚至有一些美国人和欧洲人也会来中国做博后。

现在中国政府正在鼓励宋宝亮这样的科研大牛招聘外国研究人员,从而增加我国在生命科学领域的竞争力。宋宝亮实验室的许多应聘申请都来自南亚和非洲的研究生。对于有兴趣暂时离开海外的研究人员,耶鲁大学(Yale University)的印度博士后Arunima Chaudhuri(见“访谈Anima Chaudhuri”一节)建议,如果你是打算回国,那么要选择本国研究相对落后的领域。即你应该走出你的舒适区。

新加坡国立大学(National University of Singapore)的细胞内运输专家Wanjin Hong对全球膜研究者的流动有很好的了解。他表示,他实验室的研究生全部来自欧洲和亚洲,尤其是中国、马来西亚和东欧。同时也有相当大一部分来自英国曼彻斯特大学(University of Manchester),因为该大学与新加坡国立大学有联合培养协议。Hong指出,他们能看到学生的各种能力混合在一起。他特别声称中国学生的申请不再具有竞争力,但那是因为他们在国内有更多的机会,毕竟现在中国有很多优秀的膜科学研究者。

回到香港,张良方反思了年轻科学家在美国的前景。他不认为这个领域的就业市场是饱和的——即膜科学非常广泛,而且变得越来越广泛。虽然膜科学研究确实很难,但他认为,主要的挑战其实是首先要有一个想法,并且能很好地沟通。这就是跨学科合作所需要的,而跨学科领域是最能出创新成果的地方。

 

 

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访谈Anima Chaudhuri:细胞生物学家的一天

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Arunima Chaudhuri是耶鲁大学(Yale University)的博士后,在那里她使用显微镜研究膜融合。她告诉我们,跨学科和灵活性对膜科学研究的重要性,以及她的职业规划。


你的研究内容是什么?

超分辨率显微镜。我们使用超分辨率显微镜来观察自然状态下的亚细胞组分。我研究蛋白质,如synaptotagmin-1——参与膜融合机制的一种重要蛋白。20世纪90年代科学家们通过对Synaptotagmin-1基因 “敲除”的小鼠进行实验,从而发现了Synaptotagmin-1的基本功能。但目前的观点是,敲除一个蛋白质,并观察它引起的变化可能无法全面揭示蛋白质的功能。因为生物系统中存在一些冗余部件。所以,如果你想完整地研究一个蛋白,你将需要不同的方法——比如在活细胞中观察其精微结构。

实验室里典型的一天是怎样的?

基本上我整天都在与人交谈,因为我和来自不同领域的专家合作。我用的是定制显微镜,所以我需要物理学家来帮我调整它。我需要化学家的帮助来使用荧光分子标记目标蛋白,我需要程序员的帮助来处理项目产生的大量数据。一旦实验出现问题,我需要和这些专业人士一起讨论,然后进行一些新的尝试。

你是怎么开始这个项目的?下一步计划做什么?

我的研究课题跨度非常大——我研究过人体生理学、海洋生物技术,最后获得了膜生物学方面的博士学位。但我的简历比较漂亮:我发表了论文,并做了演讲,否则我也进不了大实验室。我还获得了富布赖特奖学金(Fulbright fellowship),这为我提供了今后两年的博士后津贴——这对我全身心投入实验非常有利!我想建立自己的实验室,获得教职。鉴于膜科学越来越火,几年之后,我应该能申请世界各地大学的教职——只要我能利用自己所学到的经验和技术。

 

 


原文检索:
Anna Petherick. (2017) Blood boosts bids to unpick membrane science. Nature, 551: S181-S183.

张洁/编译

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