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胚胎组装101

Jul 10, 2018 No Comments

胚胎组装101

 

尽管新技术为人类最早期的发育阶段的研究工作提供了新信息,但也引发了伦理问题。

2013年年中工作最紧张的两周里,英国剑桥大学(University of Cambridge)的发育生物学家Magdalena Zernicka-Goetz尝试打破世界纪录。她们试图在实验室里,在空前的长时间里培养人类胚胎。他们希望深入了解一小块细胞如何将自身转化为复杂的多部分结构。此前实验室培养人类胚胎的时长通常仅为一周,但是Zernicka-Goetz知道,这个时间节点之后,关于人类发育,还有很多未解之谜。

胚胎材料来自于捐赠的、体外受精(In vitro fertilization, IVF)手术产生的、但被抛弃的的胚胎。研究小组根据小鼠胚胎培养的方法适当调整,将这些人类胚胎浸泡在一种特殊的培养基中,并将它们放在一个培养箱里。由于胚胎样本必须保持在严格控制的环境中,科学家每天只能移动一两次样本,以便在显微镜下跟踪它们的发育。

日子一天天过去,6天、7天、8天,胚胎居然仍然继续发育!据Zernicka-Goetz回忆,当时大家都特别紧张,每一天都越来越兴奋。团队的第一次尝试就达到了12天,最终达到了13天。Zernicka-Goetz表示,这简直令人难以置信。大家都高兴坏了。

这一进展,以及纽约一个团队的类似的工作,是过去5年中加速人类早期发育研究的一些成就之一。人类胚胎的来源一直是有限的,因此研究人员对早期转化的了解相对较少。但现在,细胞培养方法的改进已能将体外培养人类胚胎的时长延长至两周。目前,科学家正在使用CRISPR等基因编辑技术,来建立人工胚胎样结构,以探索塑造胚胎及其支持组织的细胞信号和物理力。

这些技术正在阐明关键的早期过程,例如无法直接研究的着床阶段(微小的胚胎嵌入到子宫壁上的过程)。新的高分辨率数字图像详细揭示了肌肉和神经在几周后的发育过程中如何生长。这些发现可以更好地了解出生缺陷和发育障碍是如何产生的,以及为什么有些怀孕会流产。

但是,这些新技术正在将研究人员推向未知的道德领域。从20世纪70年代末开始,伦理学家和科学家就“14天规则”达成一致,这种规则将人类胚胎的工作限制在受精后两周——这是神经系统发育的开始,胚胎分裂的重点。到目前为止,国际公认的14天规则纯粹是假设的限制。纽约加里森黑斯廷斯中心(Hastings Center)的生物伦理学家Josephine Johnston指出,并不是说,大家都在反对这条规则。而是说,现在技术有可能突破这一限制。

 

从受精到着床

各种动物的多个早期发育过程都非常相似,只是各个物种的少数基因或信号通路会有细微不同。在哺乳动物中,科学家研究得最多的是小鼠的分子信号通路,他们通过逐一敲除或敲减基因来测试它们的作用。小鼠胚胎容易获得,并且能很好地表征人类胚胎——小鼠和人类胚胎发育最早期的许多细胞类型和组分非常相似。但研究人员开始质疑这些相似性能保持多久。加拿大多伦多儿童医院(Hospital for Sick Children)的发育生物学家Janet Rossant表示,他们已经能够探索人类早期发育的某些阶段,虽然已发现小鼠和人类胚胎的确相似,但也有很多不一样的地方。

由于人体胚胎来源有限,科学家已经开始使用高效基因编辑技术,如CRISPR-Cas9来探索胚胎发育的早期阶段。部分由于围绕胚胎遗传修饰的伦理敏感性,到目前为止只有少数群体获得了进行此类研究的授权。

例如,伦敦弗朗西斯克里克研究所(Francis Crick Institute)发育生物学家Kathy Niakan的团队获得了首个此类项目的批准。2017年,她的团队报告使用CRISPR-Cas9编辑了人和小鼠胚胎干细胞中表达的基因。这种基因被敲除后,人类胚胎缺乏一种名为OCT4的蛋白质,并且未能发育成胚泡——包含大约200个细胞的球体。相比之下,缺乏相同基因的小鼠胚胎则能够形成胚泡,并且在后期才出现发育缺陷。

这种差异支持了一种日益受到认可的观点:即使在非常早期的发育过程中,一些遗传细节——例如某些基因的活跃——也可能是人类特有的。Niakan表示,我们知道大多数IVF胚胎无法发育至胚泡阶段,不过原因尚不清楚,了解哪些信号可能负责引导胚胎中的第一个细胞类型的形成,可能会促进IVF技术的改善。在未来的工作中,Niakan希望研究引导一小部分囊胚细胞形成胚泡的基因,而不是引导其形成胎盘等支持结构的基因。

 

着床

在开始进入这个含有200个细胞的球体阶段后,小胚囊必须嵌入子宫壁才能存活。但是一旦发生这种情况(大约在第七天),科学家很大程度上无法研究它的发育。观察着床过程本身是第一个挑战:直到最近,研究人员仍缺乏可靠的方法来维持胚胎发育超过7天。

不过,现在科学家已经开启了那个黑匣子。在2016年5月发表的两篇论文中,Zernicka-Goetz的团队和纽约洛克菲勒大学(Rockefeller University)的Ali Brivanlou团队报告了第一批体外培养人类胚胎至12-13天的培养系统。研究人员表明,通过适当的生长因子和营养混合物,培养的人类胚胎可以“着床”到培养皿的底部。值得注意的是,胚胎不需要任何母体组织来触发着床后发生的早期重塑步骤。Brivanlou指出,这对他来说很震惊,他原本以为人类胚胎甚至无法度过着床于培养皿底后的一两天。

着床在培养皿底部的胚胎比真实的胚胎更扁平。(Brivanlou将着床过程比作降落伞着陆。)但是,相比于动物实验或流产后的胚胎样本试验,体外培养的胚胎研究仍然取得了一些里程碑式的发现。在最新的实验中,胚胎附着在培养皿上后,外层细胞层开始分化为早期胎盘和支持胚胎生长的其它细胞类型。在内部,细胞似乎发育成胚胎本身和卵黄囊的前体——一种向胚胎供血的早期结构。在将近两周之后,两个团队按照14天的规则结束了实验。
到14天,虽然一些胚胎的发育仍然停滞不前,但研究人员表示,这些培养系统可以帮助他们发现胚胎前两周的更多细节。

在原肠胚形成的过程中,第三周发生了几个关键事件。胚胎开始形成一个身体轴线,一端会形成头部。细胞开始迁移并分化成三层,最终会产生身体的所有器官和组织(参见图“早期发育”)。这一过程的重要性是制定14天规则的主要原因。

 

 

发育过程1发育过程2

 

但一些研究人员正在寻找替代方法,使用人类干细胞技术构建合成胚胎样结构,这些结构不受14天规则约束。这些构建体缺乏完全发育所必需的某些组分,并且即使着床也不能产生完整个体。2014年,Brivanlou和Eric Siggia等人报道了使用特殊生长的人胚胎干细胞模拟了体外原肠胚形成的过程。他们发现,当干细胞被限制在几百微米宽的圆圈内生长时,它们会分化成一个公牛眼图案,其中包含三种主要细胞类型,这些细胞类型会产生未来身体的所有部分。人们已经在几乎所有动物中,从扁虫到灵长类动物,发现这些细胞类型具有相似的作用:最中心的细胞变成皮肤、大脑和神经系统;外面的环形成肌肉、血液、骨骼和各种器官;最外环形成消化道和呼吸系统。

这些扁平的环看起来不像真正的人类胚胎中形成的三维三胚层,但在细胞和分子水平上,该构造达到了研究人员的预期。Siggia实验室的前博士后研究员Aryeh Warmflash表示,这是一个我们可以真正剖析信号通路和细胞命运之间关系的系统。

该系统的后续研究已经揭示了关于胚胎细胞如何使用几何和化学信号自我组织成不同组织类型的新细节。2016年,Brivanlou和Siggia等人证明,干细胞可以感知它们在圆环中的位置,并相应地调整它们对生长因子的反应,以形成不同的细胞区域。在2017年发表在bioRxiv服务器的预印本中,位于德克萨斯州休斯顿赖斯大学(Rice University)的Warmflash小组证明了生长因子的动态也起了作用:研究人员发现,一组特定蛋白质(统称为Nodal途径)的信号传导激增,从细胞群周边向内扩散,就像波浪一样,波浪的不同位置形成了不同的细胞类型。

今年5月,Brivanlou的小组进一步采用了该系统,证明用生长因子的组合处理这些类型的细胞群会诱导“组织者”细胞的形成。在动物中,这些特殊细胞引导它们的邻居细胞形成头对尾轴。但是,部分由于14天的规则,科学家从未见过人类组织者细胞的作用。鉴于使用人类胚胎的伦理和技术限制,Brivanlou转而将假定的人类组织者细胞移植到发育中的鸡胚肽上。结果他们观察到,嫁接细胞可以诱导鸡细胞发育成第二个鸡神经系统。

 

支持结构

关于早期人类发育的许多研究都集中在胚胎本身,但其它组织对胚胎生存也至关重要。这些组织包括容纳胚胎的羊膜囊和提供氧气和营养素的胎盘。

为了更好地研究羊膜囊是如何发育的,研究人员创建了一个使用人类干细胞的模型。去年,密歇根大学(University of Michigan)安娜堡分校的发育生物学家Deborah Gumucio和生物工程师Jianping Fu发表论文指出,当他们在凝胶培养基上培养人类干细胞,并用天然支架分子包围它们时,细胞自组织成类似于羊膜囊的结构。大约24小时后,细胞团打开一个孔,随后,细胞开始在一侧变平,并在另一侧伸长,这是原肠胚形成过程的标志性特征。

尽管该模型仅仅模拟了胚胎和胎囊,没有胚胎存活所必须的其它支持组织,不过研究人员仍然能够识别出一些可能有助于产生这种不对称结构的分子信号。Gumucio表示,鉴于这种模型提供了很多信息,所以没必要再去构建更接近胚胎的模型了。科学家将其胚胎样培养物保持长达5天,大致相当于发育期9-14天,然后结束了实验。

Zernicka-Goetz的团队正在努力开发更完整的结构。2017年,该团队培养了两种类型的小鼠干细胞的混合物:一类细胞形成胚胎本身,另一类有助于形成胎盘,被称为滋养细胞干细胞。这些细胞被嵌入3D支架,着床于培养皿底后,形成了类似胚胎的结构。现在,研究人员正致力于使用人类干细胞创建一个类似的胚胎样结构。这样的发育过程可以帮助科学家更多地了解胚胎组织和胎盘等胚胎外组织之间的互动。

随着一些实验室开发出日益复杂的合成模型,即类胚胎,人们开始思考伦理道德的问题。缅因州巴尔港杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)的干细胞生物学家Martin Pera认为这确实是一片灰色地带,我们该如何看待正在发育的这些结构?许多伦理学家和科学家都认为,目前版本的合成胚胎过于简单化,不符合14天规则。但俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学(Case Western Reserve University)的生物伦理学家Insoo Hyun则表示,确定哪些特征可以使胚胎足够逼,真是一个挑战。如果把培养14天以上的人类胚胎植入子宫,它可能会继续发育成完整个体。

 

身体形成

研究人员也争取在后期发育阶段的细节方面取得进展。很多进展得益于更好的组织染色和成像技术。2016年,阿姆斯特丹大学学术医学中心(University of Amsterdam’s Academic Medical Center)的研究人员对来自于卡内基科学研究所(Carnegie Institution for Science)的15000个切片进行了数字化处理,并将结果发表在《科学》(Science)杂志上。该系列切片包含从19世纪80年代到20世纪上半叶,从流产、手术和尸检中获得的样本。在该研究中,研究人员对发育前两个月进行了数字化追踪,分析了单个切片上多达150个器官的轮廓,然后对切片开展比对工作,以重建原始胚胎的3D模型,构建交互式图谱。

高分辨率地研究胚胎已经取得了一些成果。例如,研究小组发现,被认为在发育过程中位置上移的肾脏和位置下移的性腺,似乎只是在体内上升和下降,因为与椎骨相比,它们以不同的速度生长。

但卡内基系列切片的一个主要限制是缺乏分子标记,这使得难以区分不同的细胞类型。为解决这些问题,巴黎法国国家健康与医学研究所(French National Institute of Health and Medical Research,INSERM)的Alain Chédotal于2017年发布了一份新的3D图谱,其中包含36个人类胚胎和胎儿,涵盖6-14周的发育过程。Chédotal等人对捐赠的标本进行了组织清除处理,使样品在显微镜下更容易成像,并对它们进行染色以突出各种细胞类型。

 

 

胚胎组装101(2)

该图像显示妊娠9周时手掌中的神经分支。

 

 

得到的3D图像以高分辨率细节显示出神经、肌肉、肺和其它器官。来自华盛顿霍华德大学医学院(Howard University College of Medicine),负责挖掘关于四肢肌肉发育的信息数据集的Rui Diogo指出,之前的研究都没有这么深入的细节。

在尚未发表的结果中,Diogo的团队观察到许多手足肌肉在发育过程中消失或融合。Diogo指出,在胚胎阶段,我们就拥有了成年阶段所没有的肌肉。在其它意想不到的发现中,Chédotal表示,尽管左右手的神经组织相似,但每只手中的精细分支模式在前7-11周内是沿着不同的路径分叉并向外延伸的。

 

发展中的胚胎发育学领域

随着科学家改进技术,他们希望更多地了解人类发育,并阐明流产和出生缺陷的原因。

现在胚胎的早期发育变得更加清晰,对道德限制的讨论也是如此。Zernicka-Goetz和Brivanlou的实验使一些研究人员认为重新评估14天规则利弊的时机已经成熟。5月,莱斯大学贝克研究所健康与生物科学中心(Baker Institute Center for Health and Biosciences at Rice University)主办了包括30位美国科学家、伦理学家和其他专家,包括Brivanlou和Johnston的会议,议题是否以及如何改动限定天数。参加此次活动的Hyun认为最好保持14天的规则,但允许少数情况下申请特批。

随着相关成果的积累,技术的进步激发了科学家的迷恋和不安。Johnston指出,这两种反应都有价值。她补充,这种奇妙和敬畏的感觉提醒我们,这是人类最早的版本,这就是为什么这么多人都有伦理上的担忧。它提醒我们,这不仅仅是培养皿中的几个细胞,它还可能发育成和我们一样的个体。
 

原文检索:
Helen Shen. (2018) The labs growing human embryos for longer than ever before. Nature, 559: 19-22. 
张洁/编译

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