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shRNA表达克隆

2. 遗传控制和表观遗传控制

Nov 29, 2010 No Comments

有好几个基因都参与了EMT的调控功能,研究发现,这些基因在肿瘤细胞中都会因为遗传的或“后天的(表观遗传学)”作用而发生改变(背景知识2)。正如前文所述, 细胞会通过各种机制稳定的缺失上皮细胞钙粘蛋白。比如编码上皮细胞钙粘蛋白的CDH1基因突变就是遗传性弥漫性胃癌(hereditary diffuse gastric cancer)的病因。而且在CDH1基因发生突变的人群中有一部分罹患乳腺小叶癌(lobular breast carcinomas)的风险也要明显高于常人。这同样是因为,在乳腺小叶癌患者中,CDH1基因经常会出现体细胞性遗传失活(somatic genetic inactivation),但CDH1基因失活也不一定会诱发EMT过程,这和我们前面提到的用RNA沉默方法抑制上皮细胞钙粘蛋白表达的情况有所不同。

 

背景知识2:表观调控机制
表观调控机制包括DNA甲基化、染色质或组蛋白修饰、以及非编码RNA调控等方式。每一种机制都在干细胞功能和干细胞分化,以及肿瘤形成过程中发挥了调控作用。比如DNA甲基化就在抑制基因表达,基因印记和X染色体失活等过程中发挥了重要作用。此外,DNA甲基化还与某些基因的细胞特异性表达现象有关。
DNA甲基化和基因印记作用发生遗传异常会引起胚胎发育缺陷,增加肿瘤的患病几率。最近的研究还表明,DNA甲基化水平异常和染色质的改变会在细胞发生基因突变之前就能够促进肿瘤形成。DNA甲基化过程和染色质修饰之间存在着相关性,非编码RNA可能就是联系它们之间的纽带。在最近几年里,我们新发现了好几种组蛋白修饰方式以及参与组蛋白修饰过程的酶。最近又发现在哺乳动物细胞中,非编码RNA与DNA甲基化和组蛋白修饰也有关,这也已经逐渐成为了非编码RNA研究领域的一个新的发展方向。

 

通过这种对应机制的作用,那些所编码的转录因子能够特异性诱导细胞获得干细胞表型的基因会发生低甲基化,从而促进EMT过程发生,在肿瘤细胞里则表现为促使细胞去分化并增强其转移能力。比如最近有人对干细胞样的CD44+CD24–细胞和来自正常组织或新生乳腺组织的已分化CD24–CD44+细胞的DNA甲基化情况作了一个全面的分析。该研究发现了几个能诱导EMT过程的转录因子,这些转录因子的编码基因在CD44+CD24–细胞中都表现为低甲基化水平,因此能够高表达,而在CD24–CD44+细胞中甲基化水平明显增多。在MCF-12A细胞或MDCK细胞中异位表达FOXC1蛋白也能诱导EMT转换现象出现,这是因为降低了胞内的上皮钙粘蛋白表达水平,增加了波形蛋白(vimentin)的表达,促进了细胞的运动能力和浸润能力。基于这种基因低甲基化导致EMT的理论,有人对MCF-7乳腺癌细胞给予5-氮杂胞苷(5-aza-cytidine)进行了实验。5-氮杂胞苷是一种DNA甲基转移酶(methyltransferase)抑制剂,它能上调与EMT过程相关的促细胞侵袭基因(pro-invasive EMT-associated gene)的表达,增强细胞的侵袭能力和转移能力。这些研究结果提示我们,需要谨慎对待使用DNA甲基转移酶抑制剂来治疗乳腺癌的这种方法,因为这会增加肿瘤细胞的播散转移风险。

2.1 转录调控机制
在图1和表1中我们列举了大概6至8种转录因子,它们被证实能够调控胚胎发育过程和肿瘤发生发展过程中的EMT作用。这些转录因子中既有能够直接抑制上皮钙粘蛋白表达的SNAI1、SLUG(又名SNAI2)、SIP1(又名ZEB2)、E47(又名E2α)等转录抑制因子(transcriptional repressors),也有TWIST1、FOXC2、FOXC1、GSC、ZEB1等间接对上皮钙粘蛋白表达发挥作用的因子。越来越多的证据表明,这些转录因子间大量的相互作用使得它们能够形成一个信息网络,来诱导上皮细胞表现出间质细胞的表型并且长期维持这种表型。另外,还有一些转录因子,比如TWIST1还在抵抗细胞衰老,诱导肿瘤干细胞形成的过程中起到了关键性的作用。正如前文中所提到的,EMT诱导转录因子同时也能赋予上皮细胞干细胞的表型,见图1。KIT受体这个在造血系统中对维持造血细胞的干细胞状态起到重要作用的因子也支持了上述理论,因为在小鼠和人体试验中都发现,KIT蛋白能诱导SNAI2的表达。

2.2 非编码RAN对EMT和肿瘤转移过程的调控作用
我们现在越来越认识到非编码RNA在基因表达调控方面占据了十分重要的地位。最近有好几个研究都发现,非编码RNA能够激活EMT程序,这些RNA包括miR‑200家族(miR‑200a、 miR‑200b、 miR‑200c、 miR‑141、miR‑429)和miR‑205等。同时还发现ZEB2基因的天然反义转录产物(anti-sense transcript)也具有同样的功能。在所有这些研究中都发现了一个共同点,那就是在所有的EMT调控途径中,上皮钙粘蛋白的表达都会受到抑制。

有两个独立的研究团队运用两种完全不同的方法分别发现了miR‑200家族和miR‑205在EMT程序中的作用。在其中一项研究中发现,各种不同肿瘤细胞中的miRNA表达模式都与细胞表现为上皮细胞特征还是间质细胞特征有关,而这又可以通过上皮钙粘蛋白(CDH1基因)和波形蛋白(vimentin,VIM基因)的mRNA水平来判断。miR‑205的表达水平以及miR‑200家族成员的表达水平也都会随着波形蛋白mRNA的表达水平而“反向运动”。后续的研究工作又发现,这些miRNA的靶标包括ZEB1和ZEB2这两种能够诱导EMT过程发生的转录因子,它们都能抑制上皮钙粘蛋白的表达。后来又在原发性人体卵巢浆液性乳头状癌(primary human serous papillary carcinomas of the ovary)中发现这些miRNA的表达都与CDH1基因呈正相关,与VIM基因呈负相关。

另一项研究发现,在马-达二氏犬肾(Madin–Darby canine kidney,MDCK)细胞中,细胞如果经TGFβ或者酪氨酸磷酸酶PEZ的诱导进入EMT程序之后,miR‑205和miR‑200家族成员的表达均有下调。ZEB1和ZEB2仍然是这些miRNA的作用靶标。而且,这些miRNA分子的表达下调足以诱导EMT过程的发生,同时如果异位表达这些miRNA分子,则能够诱发MET过程。

还有一些科研人员在人结肠癌细胞中利用SNAI1诱导发生的EMT过程发现了另一种调控ZEB2基因mRNA水平的机制。细胞在SNAI1蛋白的诱导下进入EMT程序之后,ZEB2蛋白的表达会随之增加,因为ZEB2基因的mRNA水平有所提高,但是并没有发现ZEB2基因的转录水平有明显的改变。Beltran等人结合了好几种手段发现,ZEB2的表达是由一自然反义转录产物所调控的,该转录体能够阻止包含有内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site)的5’非翻译区(untranslated region,UTR)中一大段内含子被剪接。该5’UTR区还含有一段序列,该序列能够抑制核糖体扫描(ribosome scanning),从而降低mRNA的翻译效率,导致上皮细胞中ZEB2蛋白的水平降低。不过在EMT程序激活时,这种反义转录产物的水平会升高,它与5’UTR结合之后会抑制其剪接,从而保留了内部核糖体进入位点,增强了mRNA的翻译效率,增加了ZEB2蛋白的水平,因此也就降低了胞内上皮钙粘蛋白的含量。

非编码RNA通过对EMT和MET的调控也参与了肿瘤浸润和转移过程的调控。比如对转移乳腺癌细胞和非转移乳腺癌细胞中候选miRNA的分析表明,miR‑10b是与细胞获得间质细胞表型和侵袭转移能力有关的miRNA。随后又有研究人员发现,miR‑10b能够被TWIST1蛋白诱导,而胞内TWIST1蛋白水平升高之后也会抑制HOXD10基因的表达,上调RHOC蛋白的水平,从而增强细胞的侵袭和转移能力。还有一点需要提及的是,在出现转移灶的患者体内原发肿瘤细胞中miR‑10b分子的表达水平会更高一些。

与miR‑10b作用相反,有人对MDA-MB-231乳腺癌转移细胞和非转移细胞进行芯片分析之后发现,miR-335可以抑制肿瘤侵袭和转移。miR-335似乎能够通过影响转录因子SOX4和胞外基质蛋白粘蛋白C(tenascin C)的表达来抑制肿瘤转移。Tavazoie等人还发现了一种miR-335基因标签(gene signature),该标签由6个基因组成,它们分别是COL1A1、MERTK、PLCB1、PTPRN2、TNC和SOX4基因。这些基因的表达会受到miR-335的抑制,不过在转移瘤细胞中,它们的表达水平会升高。这种miR-335基因标签还与乳腺癌患者无转移发生生存率较低的现象有关,这也说明了miR-335在肿瘤转移调控中发挥了一定的作用。在将来,随着发现鉴定非编码RNA技术的进步,以及非编码RNA功能研究手段的丰富,我们必将能够发现更多的非编码RNA在EMT和MET过程中发挥关键的调控作用。现在,大家都逐渐认识到miRNA与细胞生理的各个方面都有联系,因此我们有理由相信,miRNA和蛋白质一起,在细胞调控机制中发挥了主要作用。

 

 

3. 间质细胞-上皮细胞转换
最近的研究表明,具有与EMT过程相关基因表达标签的原发肿瘤发生转移的可能性会更高,患者的无转移生存时间也更短。不过我们反复观察的结果却是转移灶肿瘤组织主要是由表现上皮细胞表型的肿瘤细胞组成,即与原发灶肿瘤细胞比较类似,但这种现象与上述EMT会促进肿瘤转移的观点看起来非常矛盾。如果肿瘤细胞必须经过EMT转换才能播散转移的话,为什么转移灶肿瘤细胞会与原发灶细胞在组织学水平上如此相似呢?

实际上,这并不矛盾,因为在肿瘤细胞经历EMT转换转移到远隔部位之后还会再经历一个MET转换,让转移瘤细胞回复到上皮细胞状态(图2)。有好几项研究都表明,CDH1基因启动子的DNA甲基化水平会随着肿瘤转移的进程而不断发生变化。在原发乳腺癌细胞中,肿瘤细胞会发生一个短暂的超甲基化,抑制CDH1基因的表达,增强肿瘤细胞的侵袭性和转移能力,但是肿瘤细胞完成转移之后,上皮钙粘蛋白的表达又会再次增强,这是因为CDH1基因启动子又经历了一次去甲基化修饰。不幸的是,这些研究都没有对肿瘤细胞进行克隆鉴定。还有一种可能就是原发肿瘤细胞中具有上皮细胞DNA甲基化状态的肿瘤细胞发生了转移,因此转移灶处的肿瘤细胞也就表现为上皮细胞表型。因此,EMT-MET转换理论还值得进一步的推敲、验证。

 转换过程示意图

图2 在肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞在上皮细胞状态与间质细胞状态之间转换过程示意图。在肿瘤原发灶中,EMT过程和MET过程都与肿瘤细胞异质性(heterogeneity)现象有关,而肿瘤细胞异质性现象正是肿瘤难以治疗以及容易发生转移的一大原因。粒细胞和肿瘤相关成纤维细胞等间质细胞之间的相互作用可能会触发EMT转换过程,赋予上皮样肿瘤细胞间质细胞或者肿瘤干细胞的表型,从而促进肿瘤细胞的生长和存活。肿瘤干细胞更容易发生转移,也更容易从循环系统和微小转移灶(micrometastases)中被检出。不过临床可见的巨大转移灶(macroscopic metastases)更主要的是由分化更好的上皮样肿瘤细胞所组成。这是因为在微小转移灶形成之后,又会出现一个MET转换,将EMT转换得来的细胞回复成上皮样肿瘤细胞。之所以会出现这种回复过程可能是因为,在转移灶处的局部选择压力使得具有上皮细胞表型的肿瘤细胞更适于生长,或者是因为缺乏EMT诱导信号的刺激。不过,我们也不能排除,是上皮样肿瘤细胞和间质样肿瘤细胞相互合作促使肿瘤转移发生的。

 

背景知识3:小非编码RNA
最近发现的一些小非编码RNA属于一大类新型的基因表达调控因子,它们可能是在转录后水平发挥调控作用,可能还参与了表观遗传调控过程。在最近这几年里,研究发现miRNA和piRNA对于干细胞的功能、细胞分化以及胚胎发育都是必须的。而且,miRNA还具有促进肿瘤形成和抑制肿瘤形成的作用,miRNA是一段19~25bp长的单链RNA分子,它由Rnase III经过一系列催化作用得来。miRNA会参与形成miRNA诱导的沉默复合体(miRNA-induced silencing complexes,miRISC)。一种miRNA分子能与多种mRNA靶标结合,抑制其翻译,甚至促进其降解。在某些情况下,miRNA还能通过某些未知机制影响基因转录。piRNA在生殖细胞(germ line)里起到了调控转座子移动的作用,它们还可能在体细胞里参与细胞生理过程的调控,不过目前机制还不清楚。

 

4. EMT和MET的临床重要性
EMT转换过程与肿瘤的两大重要特性有关,这两大特性分别是肿瘤转移以及肿瘤抵抗治疗。这两大特性可能都与EMT转换所导致的肿瘤细胞干细胞样特性有关。有两个研究小组都分别发现,在乳腺上皮细胞里能诱导EMT过程的转录因子TWIST1或SNAI1表达之后,通过细胞表面抗原检测、基因表达谱检测、能否形成mammosphere的检测以及异体移植后能否形成导管等检测方法发现,干细胞样细胞的数量都会明显增多,使用TGFβ也能得到同样的结果。其中一个研究小组分别对从正常人体乳腺组织和原发乳腺癌组织中分离出的CD44+CD24–细胞进行了与EMT过程有关基因表达情况的分析,结果发现能够诱发EMT转换的转录因子,比如TWIST1、 FOXC2、 SNAI1、 ZEB2 (又名SIP1)、TWIST2等,以及波形蛋白(vimentin)和纤维连接蛋白(fibronectin)在CD44+CD24– 干细胞样肿瘤细胞中的表达水平要比在分化程度更高的CD44+CD24–上皮样肿瘤细胞中高的多。这些实验结果加上以前的研究成果一起表明,在CD44+CD24–乳腺癌肿瘤细胞中与肿瘤浸润、转移和血管生成相关的基因都有上调,同时细胞的侵袭和转移能力也增强了。同时,研究还发现,播散到循环系统和骨髓中的乳腺癌细胞中表现为CD44+CD24–抗原表型的细胞数量也明显增多。

大量出现的CD44+CD24– 干细胞样肿瘤细胞以及与EMT过程相关的基因大量表达这些现象都与基底细胞样乳腺癌有关(basal-like subtype of human breast cancer)。对479例乳腺癌样品进行免疫组化分析后发现与EMT过程有关的蛋白,比如波形蛋白、α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin)、神经钙粘蛋白(neural cadherin,N-cadherin)、SPARC蛋白、层粘连蛋白(laminin)以及成束蛋白(fascin)等都会大量表达,而上皮钙粘蛋白的表达量相比其他类型的乳腺癌细胞则会下降。这些肿瘤因为容易发生转移,所以预后都比较差。另一个研究小组分析了117例原发侵袭性乳腺癌样品中能诱发EMT转换的转录因子FOXC2的表达情况,结果发现该因子与基底细胞样乳腺癌关系密切。结合这些实验结果以及双重免疫组化检测(dual immunohistochemical analysis)结果证明,基底细胞样乳腺癌细胞就是CD44+CD24–肿瘤细胞。

EMT转换机制对于肿瘤抵抗临床治疗也具有十分重要的作用。在经过标准化疗之后的肿瘤“残余”灶中,剩余的肿瘤细胞大部分都是干细胞样肿瘤细胞。比如给予乳腺癌患者新辅助疗法(neoadjuvant therapy)和标准的蒽环霉素及紫杉烷化疗(anthracycline–taxane chemotherapy)之后,在活检组织中可以发现,表达有与EMT过程相关基因的CD44+CD24–细胞的数量明显增多。但是对ERBB2+的乳腺癌患者用表皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)和ERBB2双重抑制剂拉帕替尼泊(lapatinib)治疗之后则不会出现这种情况。对于某些肿瘤而言,比如肺癌和结肠癌,细胞经历EMT转换之后,对于EGFR激酶抑制剂的敏感性会降低,这可能是因为细胞活化了EGFR激酶的下游因子PI3K和Akt,从而不再需要EGFR激酶信号通路的作用。

EMT转换作用和肿瘤细胞随即表现出来的肿瘤干细胞特征也都与肿瘤细胞的抗凋亡机制相关。对EpH-4和NMUMG鼠乳腺上皮使用TGFβ诱导EMT作用之后,这些上皮细胞都对紫外线诱导的凋亡机制产生了抵抗作用。同样,在乳腺癌细胞中,下调let‑7 miRNA的表达水平能够增强肿瘤细胞的转移能力,同时也能使肿瘤细胞对治疗产生抵抗。这都是因为肿瘤细胞获得了干细胞特征,该细胞的基因表达谱也会变成与EMT过程相关的基因表达模式。将肿瘤上皮细胞和间质成纤维细胞共培养,或者将肿瘤上皮细胞置于缺氧的环境之中也能使它们对治疗产生抵抗,这也有可能是因为细胞发生了EMT转换。

5. 结论
越来越多的证据表明,EMT和MET转换在肿瘤细胞可塑性(cellular plasticity)调控机制中起到了非常关键的作用。同时,它们对于肿瘤、转移复发和肿瘤细胞的治疗耐受现象也负有重要责任。EMT和MET程序的作用以及相关的调控因子对于某些肿瘤,尤其是神经外胚层肿瘤(neuroectodermal neoplasias)、间质肿瘤(mesenchymal neoplasias)和造血系统肿瘤(haematopoietic neoplasias)的作用还需要做进一步的研究。由于EMT转换而带来的种种结果在临床上都具有非常重要的意义,因此,抑制EMT转换过程就成为了一个相当有前景的治疗方案。不过由于调控EMT过程的信号通路网络太过复杂,加上还存在一个可以逆转EMT转换结果的MET转换机制,这使得情况变得更为错综复杂。另外,哪一些肿瘤细胞应该被治疗,应该在肿瘤发展的哪个阶段给予治疗,对于这些问题我们还都一无所知。最近的研究显示,肿瘤细胞在肿瘤发展早期就已经开始全身性播散(systemic dissemination),那么在临床诊断出患有肿瘤之后再给予EMT抑制治疗就已经太晚了。不过如果肿瘤转移是接续式的(即一个转移灶再播散、转移形成下一个转移灶),那么使用EMT抑制疗法应该可以抑制后续的肿瘤转移现象发生。

我们现在还不清楚,在抑制EMT过程时抑制哪个(些)信号途径才能获得最佳的治疗效果,同时对身体的毒副作用达到最低。EMT程序与正常干细胞程序之间的相似性使得EMT抑制疗法的毒副作用成为了一大障碍。同时,EMT程序与MET程序的可逆特点也让我们对EMT抑制疗法的疗效表示怀疑。另外还有一个关键问题就是,因为肿瘤出现转移往往需要数年,甚至是数十年的时间(比如乳腺癌),那么我们该如何在出现肿瘤转移之前就能够判断出EMT抑制疗法是否有效呢?

我们上面提及的种种问题都表明,尽管我们经过了大量的努力,发现了EMT和MET背后的一些分子机制,也证明了它们对于临床肿瘤患者的重要意义,但是要根据EMT和MET机制开发出有效的抗癌疗法,我们还有一些重要的基本问题需要解决。不过我们相信,随着科研人员们的不懈努力,这些问题一定会在不久的将来被逐一解决。

小词典
基因印记:高等动物的基因组为两倍体,受精卵从双亲中各继承了一套基因组。每一个常染色体均为双拷贝,父源和母源常染色体基因都能有均等的机会表达或受到抑制,这是孟德尔遗传定律的基本要素。上世纪90年代开始,发现了不符合这个定律的遗传现象。某些基因呈单等位基因表达,即父源与母源的基因拷贝不能同时表达,并且,父源或母源等位基因通过某种特异的基因修饰机制,特异性地抑制另一母源或父源染色体等位基因表达。例如:胰岛素样生长因子2基因(insulin-like growth factor 2, IGF2)只表达源自父亲的等位基因,母源等位基因被抑制。相反的例子,胰岛素样生长因子2受体基因(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R)为源自父亲的等位基因不表达,只表达母源等位基因。这种现象可能是在父母受精卵形成过程中,特异性地对源自父亲或源自母亲的等位基因做一印记使其只表达父源或母源等位基因。这种现象被称作基因印记。基因印记的机制现在还不完全了解,从到目前为止的研究成果看,与DNA的甲基化、染色质构造的改变、DNA复制时机的变化、和非编码RNA的调节作用有关。

 

原文检索:
Kornelia Polyak and Robert A. Weinberg. (2009) Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer, 9:265-273.
YORK/编译

 

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