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从头合成细胞

Dec 12, 2018 No Comments

从头合成细胞1

从头开始合成细胞将有助于我们了解生命的本质。

 

 

仅靠八个元件、两个蛋白质、三个缓冲元件和两个脂肪分子,再加上一些化学能量,就足以形成一串“活泼好动的”基础细胞样结构,而且还可以自我分裂。

这就是生物物理学家Petra Schwille创造出来的奇迹,这些会“跳舞”的小精灵是我们从头开始合成细胞的第一步。为此,Schwille在德国马克普朗克生物化学研究所(Max Planck Institute of Biochemistry in Martinsried, Germany)付出了十年的努力。

Schwille一直在思考生命和非生命的区别。对她来说,最大的难点就在于判断哪些组份才是构成生命体的必要元素。在Schwille的人工合成细胞里,她知道每一个因素的作用。

二十多年来,科研人员一直努力地创造人造细胞,他们的方法就是将各种生物分子按照某种方式组合起来。虽然有各种各样不同的方法,但是大致可以分为以下三大类,分别是想办法将生物分子包裹在某一个空间内;或者研究足以维持生命的生物化学系统;或者研究细胞行为的信息控制、储存和管理问题。

得益于近年来微流体技术的进步,科研人员可以精细调控细胞组分之间的微小活动,所以人工合成细胞这方面的工作也在加速开展之中。目前科研人员已经找到了一些方法,可以将细胞样的小泡塑造成我们需要的样子,也创造出了一些最基本的细胞代谢能力,而且还成功地将人造基因组转移到活体细胞里。但是要想将所有成分全部组装到一块,挑战还是很大的。

但是科研人员还是充满了信心。2017年9月,荷兰17家实验室的科研人员一起组成了“构建人造细胞组织(Building a Synthetic Cell, BaSyC)”。据该组织的负责人兼荷兰德尔夫特理工大学(Delft University of Technology)的生物物理学家Marileen Dogterom介绍,他们的目标是在十年之内,人工合成出一个细胞样的、可生长和可分裂的新东西。目前,他们已经得到了1880万欧元(约合2130万美元)的荷兰引力基金(Dutch Gravitation grant)的支持。

今年9月,美国国家科学基金会(US National Science Foundation, NSF)宣布了他们的第一个人工合成细胞项目,并表示将为此投入大约1000万美元。包括Schwille在内的多个欧洲的研究人员也都建议拥有10亿欧元资金的欧盟委员会未来新兴技术项目(European Commission’s Future and Emerging Technologies Flagship)对人工合成细胞给予经费支持。

从头开始的合成生物学家都预计第一批具有真正意义的人工合成细胞将在大约十年之后诞生。Schwille就对此充满了信心。

 

全都在一起

科研人员已经在人工合成细胞的多个方面取得了不错的进展,尤其在模拟生物膜方面成果突出。这主要是因为组织分子的关键就在于如何让它们在合适的时间和地点发挥作用。虽然我们可以将十亿个细菌打碎,将细菌裂解物全都倒在一支试管里,但是这些细菌在试管里的生物学反应却不能维持很久。我们必须将其中的某些成分分离出来,同时也必须让其中的某些成分混在一起。

德尔夫特理工大学的另外一位生物物理学家Cees Dekker表示,对他来说,这就是一个分子组成的社会。

最开始,这意味着将生物分子在生物膜上,或膜结构内排列起来。Schwille及其课题组成员就是这方面的专家。大约在十年前,他们开始尝试添加Min蛋白。这种蛋白可以指导细菌分裂,并可以将人造脂质膜分裂成一片一片。后来他们又发现,Min蛋白可以让生物膜弹起来,形成波动(wave)和旋动(swirl)。但是将Min蛋白加入3D立体的球状生物膜结构中时,生物膜球会破裂。于是Schwille等人尝试使用微流体技术来解决这个问题,从而构建出了细胞大小的生物膜结构——脂质小体(liposome)。这种脂质小体解决了蛋白质加入的问题,我们可以在其中,或者表面插入各种蛋白质。

Schwille的学生Thomas Litschel等人将Min蛋白溶于水,然后将这些蛋白溶液放入试管,
并在振荡器上快速振荡,随后这些溶液形成了蛋白小液滴。紧接着再将它们与浓稠的脂质液体混合,离心,就能够形成包裹了Min蛋白的脂质小体。这种脂质小体大约有10~20微米大小,刚好就是植物和动物细胞的水平。这些脂质体也被称作巨大单层囊泡(giant unilamellar vesicles, GUV)。虽然很多方式都可以制备这种物质,但是Litschel等人的GUV因为有了Min蛋白,所以可以震动、收缩,并且四处游动。

Schwille等人希望利用他们对这些Min蛋白质的研究成果来吸引资金。她表示,她们真的理解这些分子,也非常想知道这些蛋白质能够做出什么。也许可以像Litschel等人那样,利用这些Min蛋白来指导生物膜分裂,或者聚集成一个个小的细胞器样的结构等。很多物理学家会使用胶带和锡箔来做实验,Schwille觉得她们手上的那些蛋白也可以起到类似的作用。Schwille认为自己天生就是一个专门做实验的材料。

 

 

脂质小体制造技术

脂质小体制造技术
科研人员利用微流体技术来生产脂质小体。这些脂质小体与细胞膜结构非常类似。其中有一种技术会用到6条微流体,使它们汇集到一处,如上图所示。在1-辛醇的环境中,脂质双分子层会被包裹在内部。经过几分钟之后,这些1-辛醇会脱落,剩下完整的脂质小体。

 

Dekker的团队成员还利用上图所示的微流体芯片往脂质小体里塞进了各种蛋白质。在这种微流体芯片里,有两个通道充满了脂质分子,还有一个通道里充满了水分子,最终产生的细胞大小的脂质小体里就可以装入各种生物分子了,也可以保持膜的状态,在容器里自由地漂浮。

Dekker的团队还对这些脂质小体进行了加压、变形和重塑等各种实验,最终获得了非球形的脂质小体,以便可以更好地模拟细胞的形态。有了微流体设备,科研人员可以更好地控制脂质小体的移动、分选和操控。Dekker等人今年还设计了一款芯片,能够人工使一个脂质小体一分为二,具体方法就是用外力将脂质小体挤成两半。当然这不是Dekker等人追求的最终目标,他们的目标是希望脂质小体可以由内而外地自发分裂。但这个实验也给我们提供了很多有意思的信息。比如,在分裂脂质小体时,脂质小体可以承受多大的力量和承受哪种力量等。Dekker团队还对活体大肠杆菌的形状进行了研究,他们用硅树脂纳米纤维材料制作了一种模子,从而让大肠杆菌变得更方、或者直径更大。他们通过这种途径来研究细胞的形状对细胞的分裂有何影响,同时了解Min蛋白在不同形状和不同大小细胞里的作用。

Dekker打趣道,他们使用纳米技术做了其他正常细胞生物学家绝对不会做的实验。但是像他这样不正常的生物物理学家都会这么干。

 

再加点能量进去

现在,我们已经可以往脂质小体里加点东西了,科研人员需要思考的问题是如何让这些细胞组份正常地运作起来。几乎所有的生命体细胞都需要能量,最常见的形式就是ATP。虽然我们也可以往人造细胞里添加ATP,但是很多从事从头合成工作的生物学家还是坚持,真正的细胞应该有自己的能量供给来源,类似于动物细胞的线粒体(mitochondrion)和植物细胞的叶绿体(chloroplast)。

德国海德堡马克斯普朗克医学研究所(Max Planck Institute for Medical Research in Heidelberg, Germany)的Joachim Spatz等人就构建了一个人造线粒体概念机,可以自发产生能量物质ATP。

他们也在其中利用了最新型的微流体技术。首先,Spatz等人将GUV置于水油混合液滴(water-in-oil droplets)里,使其能够稳定存在,这些水油混合液滴则处于一个由多聚体物质构成的黏性环境(即多聚体外壳)中。当这些水油混合液滴沉到底部的毛细通道之后,科研人员就会往其中注入大型蛋白质分子,这些蛋白质会进入GUV,或者固定在GUV的表面。

 

 

人工细胞生产线

人工细胞生产线
借助Pico微注射系统就可以往脂质小体这种人造细胞膜结构中添加各种蛋白质。首先,脂质小体被置于多聚体外壳内,待其稳定后将脂质小体注入毛细通道。在电流的作用下,目标蛋白就会被插入脂质小体内,或者脂质小体的膜上。

 

 

Spatz等人利用上图这种设备在脂质小体的膜上插入了ATP合酶蛋白质(ATP synthase)。这些ATP合酶就好像一台水车一样,当有质子通过脂质小体膜时,就可以利用ATP的前体物质,生产出ATP。实验发现,当GUV外部的酸性增强时,在GUV的内部真的产生了ATP。

Spatz表示,他们可以让这些GUV再次通过毛细通道,添加其它蛋白质,如此往复,就可以添加多种细胞组份。他们接下来就计划加入其它成分,使GUV可以自己在膜内外形成质子梯度。这样一来,就和我们人体内一样了,是非常重要的一环。

德国马堡马克斯普朗克地球微生物研究所(Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology in Marburg, Germany)的生物化学家Tobias Erb也是研究合成生物学的,他们也在细胞代谢领域里有所发现。Erb关注的是光合作用微生物(photosynthetic microbes)利用二氧化碳生成糖和其它物质的代谢途径。

Erb使用的是空板(blank-slate)方法来合成细胞代谢通路。据他介绍,从工程学的思维出发,我们首先思考的是如何设计,然后是如何将设计图真的建造出来。

Erb团队设计了一个系统,可以将二氧化碳转化成苹果酸(malate),而苹果酸就是光合作用最关键的代谢物。他们估计,这条代谢通路的效率要比光合作用的还要强。接下来,Erb团队的工作就是在数据库中搜索,看看都有哪些酶可以供他们使用。有些酶也许需要先改造一下才可以满足他们的要求。

最后,Erb团队一共找到了17种酶,这些蛋白质来自9种不同的生物。比如有大肠杆菌、古细菌(archaeon)、拟南芥(Arabidopsis)和人类。这个反应不出意外的话,效率应该是很低的。

Erb指出,虽然他们将多种酶组合在一起,但结果并不理想。不过经过人工改造之后,目前已经升级到5.4版,反应效率已经比大自然中的光合作用强了20%。

接下来,Erb等人又开始了人工叶绿体的打造工作。他们用研钵将菠菜碾碎,然后加入人造光合系统,结果在紫外光的照射下真的生成了ATP,也将二氧化碳转化成了苹果酸。Erb认为,虽然他们在试管中取得了成功,但是我们最终需要的是真正的人造叶绿体。他非常希望能够与Kate Adamala等合成生物学家合作,构建出复杂的细胞器。

美国明尼苏达大学(University of Minnesota in Minneapolis)的Kate Adamala实验室正在开发可控生物反应器(programmable bioreactors)。他们的方案就是将简单的生物通路置入脂质小体,然后将这些人造细胞聚集起来,形成复杂的生物反应器。她将这个系统比喻做“可以制造蛋白质的肥皂泡”。

Adamala团队使用和Schwille等人类似的试管旋转方法来制造她们的生物反应器,不过她们生成的脂质小体个头会小一点。Adamala团队在其中还加入了编码各种蛋白质的质粒,以及整个蛋白质表达系统。

比如,她们就制造了一种生物反应器,可以感知所处环境里的抗生素水平,因为当抗生素分子通过脂质小体膜上的小孔进入生物反应器内部时,就会产生生物发光信号(bioluminescent signal)。

如果将一个个生物反应器按照一定的顺序组合起来,就可以打造出一套更加复杂的生物反应通路。但是当反应器(或组份)的数量超过十个时,这个系统就崩溃了。这是目前合成生物学领域里面临的最大挑战。在真正的细胞里,可能会彼此影响的蛋白质都被分隔在不同的细胞器里。因此,科研人员必须想办法,了解如何在结构简单的人造细胞里控制这些蛋白质的作用,以避免它们相互影响。比如可以建造一套外部的门控系统,由操作人员来决定这些脂质小体什么时候组合,什么时候分开。还可以添加一些化学标签,控制不同的脂质小体之间的结合,或者使用时间释放控制系统(time-release system)等。

 

再来点信息

人工合成细胞除了上面那些“硬件”条件之外,还有一个重要的因素,那就是需要相应的“软件”。如何让人工合成细胞“听话”,这就需要信息的引导和指挥了。在真正的生命体(从微生物到人类)内,这就是基因负责的工作。

那么在人工合成细胞里需要多少个基因呢?这一直是大家争论的焦点。Schwille等人认为几十个就够了,可是Adamala等人却坚持至少需要两三百个。

有些科研人员没有选择从头开始的合成路线,而是选择从活细胞开始。比如美国加州J. Craig Venter研究所的合成生物学家John Glass就使用目前地球上已知的、基因组最小的微生物——蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)为原材料,通过减少该基因组里基因的数量,来了解到底多少个(哪些)基因就足以支撑一个细胞的生存。他们得到实验结果之后,就在实验室里用化学合成的方法,重新制作了一个最简基因组。

这个最简基因组一共含有473个基因,这只有蕈状支原体原始基因组大小的一半。然后,Glass等人将这个人工基因组植入山羊支原体(Mycoplasma capricolum)细胞。2016年,Glass等人发现这个人工合成基因组可以维持细胞的存活,只不过细胞的生长速度比较慢。鉴于此,他认为,不能再减少基因的数量了,否则就会让细胞死亡,或者无法维持细胞的生长。

Glass等人正在根据他们最新的研究成果JCVI-syn3.0a,编写一部“细胞任务清单(cellular tasks)”,这也将成为制作最简细胞的蓝本。但是面对这大约100个基因,还是无法区分哪些属于必需基因。

接下来,Glass和Adamala在NSF提供的大约100万美元的支持下,还将尝试将JCVI-syn3.0a基因组组装进脂质小体里,这个脂质小体里同时装载了整套蛋白质表达系统,他们想看看这个彻头彻尾的人工细胞是否可以存活。

如果这个人工细胞可以正常地生长、繁殖,那么将是一个巨大的进步。但是很多人都不认为这是一个真正意义上的活体系统,因为它还得具有进化和环境适应能力才行。Schwille认为,这也是最大的挑战,是最难预料的。一个只能复制自己的东西还不能被称作生命,真正的生命还需要发展出新的能力。

Glass的团队正在对他们的JCVI-syn3.0a进行适应性进化实验,他们在富营养环境中进行实验,因为细胞在这种条件下的生长速度更快,更有利于选择。到目前为止,细胞已经分裂了400次,Glass等人已经筛选出了生长速度比之前提升了15%的“新品种”。而且还观察到了很多基因序列变异的情况。但是目前还没有证据显示这些细胞发展出了新功能,或者提高了适应能力。

Erb认为,给人造细胞添加进化能力,是唯一的出路。生物系统里的混乱( messiness )就是让它们进步的动力。作为工程师,我们不能制造出一个完美的细胞。我们需要开发的是具有自我纠错能力,能够自己越变越好的细胞。

这些人造细胞也可以告诉我们其它星球上的生命可能是什么样子的。一个完全受控的生物反应器也可以为我们开发新的抗癌药和解决抗生素耐药问题,并为清除毒物提供帮助。如果将这些人造细胞植入人体,或者自然环境中,还是有一定风险的,但是自上而下地改造生命也同样会带来不可预知的风险,甚至会更危险。

Dogterom表示,人工合成细胞也会带来伦理和哲学方面的问题,比如它们是生命体吗?它们是自主的吗?我们应该控制它们吗?这一定会在公众与科研界之间引发争论。至于这些人造细胞会自由发展、进化,Dogterom倒不是特别担心,她相信至少第一批人造细胞还不会那么高级。作为合成生命工程师,她们也可以在人造细胞里加入控制开关,确保安全性。

Dogterom等合成生物学家将继续她们的工作。她表示,现在时机正好。我们有了人造基因组和其它所有需要的材料。细胞只需要数百个基因就可以存活。虽然几百个也不是一件容易的事情,但好歹不是几千个。

 

 

原文检索:
Kendall Powell. (2018) BIOLOGY FROM SCRATCH. Nature, 563: 172-175.

Eason/编译

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